[发明专利]一种cTnI检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种cTnI检测试剂盒，其特征在于，包括：校准品、清洗液、底物溶液、预处理液、酶结合物工作液和磁珠结合物工作液；所述预处理液中含有咪唑，所述酶结合物工作液中含有酶标记的cTnI抗体，所述磁珠结合物工作液中含有cTnI抗体标记的磁珠，所述咪唑的浓度为0.8~1.5mM；所述预处理液还包括：25~100mM的Tris、150mM的NaCl、1~5%的蔗糖、1~5%的甘油、0.1%的BSA、0.05~0.2%的Tween-20和0.05~0.2% 的Proclin-300，所述预处理液的pH为7.0~7.5；所述酶结合物工作液还包括：20~50mM的Tris、150~300mM的NaCl、1%的BSA、5%的蔗糖、5%的甘油、0.1%的Tween-20、0.02~5mM的ZnCl₂、0.02~5mM的MgCl₂和0.05~0.2%的Proclin300，所述酶结合物工作液的pH为7.0~9.0；

所述磁珠结合物工作液还包括：20~50mM的Tris, 150~300mM的NaCl、1%的BSA、1%的蔗糖、1%的明胶、0.1%的Tween-20、1%的PVP360和0.05~0.2%的Proclin300，所述磁珠结合物工作液的pH为7.0~9.0。

2.根据权利要求1所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的cTnI抗体为碱性磷酸酶标记的cTnI抗体。

3.根据权利要求2所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的cTnI抗体通过以下方法制备：

A．活化cTnI抗体

1向0.5M的TCEP溶液中加入2mg/ml的cTnI抗体，至TCEP的终浓度为1.25mM，混匀，室温下静置反应；

2将反应后的抗体溶液脱脱盐，置换到pH 7.3、100mM的三乙醇胺缓冲液中；

B.活化碱性磷酸酶

3向碱性磷酸酶溶液中加入17.5mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，混匀，室温下静置；其中，Sulfo-SMCC溶液是将Sulfo-SMCC试剂加入到二甲基甲酰胺中配制而成，Sulfo-SMCC试剂与碱性磷酸酶加入的摩尔比为（10~15）：1；

4继续加入1M的甘氨酸溶液，混匀，室温下静置反应；其中，甘氨酸与Sulfo-SMCC试剂加入量的摩尔比为（10~20）：1；

5将反应后的碱性磷酸酶溶液脱盐，置换到pH 7.3、100mM的三乙醇胺缓冲液中；

C．将步骤A中活化的cTnI抗体溶液和步骤B中活化的碱性磷酸酶溶液混合均匀，2~8℃温度下静置反应18~24h；其中，cTnI抗体与碱性磷酸酶加入的摩尔比为1：2；

D．向步骤C中反应后的溶液中加入12.5mg/ml的N-乙基顺丁烯二酰亚胺溶液，混匀，室温下静置反应，纯化反应后溶液，得到碱性磷酸酶标记的cTnI抗体。

4.根据权利要求1-3任一项所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述清洗液是含有SBS、Tween-20和Proclin-300的Tris缓冲液，所述底物溶液是酶促化学发光底物溶液，所述校准品是用校准品稀释液配制的cTnI的HEPES缓冲液。

5.根据权利要求1-3任一项所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，还包括：质控品，所述质控品是用校准品稀释液配制的cTnI的HEPES缓冲液。

6.根据权利要求4所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述校准品稀释液包括：20~50mM的BES、150~300mM的NaCI、1%的马血清、0.5~5mM的Proclin-300和1%的甘露醇，所述校准品稀释液的pH为6.5~7.5。

7.根据权利要求1-3任一项所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的cTnI抗体的浓度为0.6~1.8μg/ml，所述cTnI抗体标记的磁珠的浓度为0.2~0.5mg/ml。

8.根据权利要求1-3任一项所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠的粒径为3μm。

9.根据权利要求1所述的cTnI检测试剂盒，其特征在于，所述cTnI抗体标记的磁珠通过以下方法制备：

E．向cTnI抗体中加入pH5.0、100mM的MES缓冲液，至抗体溶液的浓度为1~5mg/ml；

F．活化磁珠

1）将100mg/ml的磁珠溶液置于磁架上静置，磁分离弃上清液；其中，磁珠溶液与cTnI抗体的质量比为100：1；

2）用pH5.0、100mM的MES缓冲液溶解步骤1）中得到的磁珠，磁分离弃上清；

3）将步骤2）中得到的磁珠溶解于100mM的MES缓冲液，继续加入0.23倍磁珠重量的10mg/ml的NHS溶液和0.1倍磁珠重量的10mg/ml的EDC溶液，室温下振荡反应；其中，NHS溶液是将NHS试剂溶解于pH5.0、100mM的MES缓冲液中得到，EDC溶液是将EDC试剂溶解于pH5.0、100mM的MES缓冲液中得到；

4）将步骤3）中反应后的磁珠溶液磁分离弃上清，然后溶于100mM 的MES缓冲液；

G．将步骤E中得到的cTnI抗体溶液与步骤F中活化的磁珠溶液混合，室温下交联反应16~24h，然后磁分离弃上清，继续加入磁珠封闭液CE210，混匀后室温反应16~24小时；

H．将步骤G中得到的磁珠溶液磁分离后弃上清，然后清洗磁珠，得到cTnI抗体标记的磁珠。