[发明专利]骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及骨髓内皮祖细胞的分离培养和分离方法。通过本发明中提供的培养基配合本发明提供的方法来培养EPC，可以使EPC快速的生长增殖，5～10ml的骨髓，在20天左右便可得到5×10⁷个细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法。

背景技术

EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞，又称血管母细胞或血管内皮干细胞，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞)和HUVEC相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的ECs。1997年，Asahara等首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究。目前，内皮祖细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来，并且内皮祖细胞的功能应用研究也取得一定成果，为临床应用奠定了基础。

骨髓中含有丰富细胞，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等，骨髓中的血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞，促进局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于治疗缺血性疾病，并取得了良好的治疗效果，具有再生和分化能力的EPCs已逐渐成为治疗血管系统疾病的理想细胞材料。因此EPCs已成为近年来生命科学研究的热点。

目前，传统的EPC分离和培养的方法如下：

1.用传统的Ficoll密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞(BM-MNCs)。

2.用人CD34+抗体包被的免疫磁珠采取磁珠分选法在BM-MNCs中分离出MNC CD34+。然后将MNC 34+单独接种于培养皿中进行培养。

3.MNC CD34+的培养：培养基的配方为DMEM或M-199+20％胎牛血清+牛脑提取物+抗生素，或DMEM或M-199+20％胎牛血清+VEGF+FGF-2+EGF+IGF-1+抗坏血酸。培养皿采用人纤维连接蛋白或明胶包被。

传统的培养方法较为繁琐，在用CD34+抗体包被的免疫磁珠分选MNC的过程中不可避免会有MNC CD34+的损失加上磁珠本身对细胞的损伤，会大大降低细胞的获得率，同时免疫磁珠分离的方法所需费用昂贵，不利于经济效益，特别随着George等提出了CD34-的概念后，证明EPC上的表型表达率均不一致，所以这种方法已经逐渐不被采用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供骨髓内皮祖细胞的分离培养基和分离方法，本发明提供的分离方法简便，细胞得率高且活率高。

本发明提供的培养基由基础培养基、人血清、bFGF、VEGF、IGF、EGF、氢化可的松、谷氨酰胺和双抗组成。

基础培养基中包含细胞生长、繁殖所需要的基本营养物质，在本发明中，基础培养基时用于配置本发明所述培养基的基础，其为液态或固体粉末。基础培养基为液态则各物质以液体培养基定容至适宜浓度，基础培养基为液态，则各物质以水定容至适宜浓度。本发明中，所述基础培养基为M199培养基。优选的，所述基础培养基为M199液体培养基。

本发明中培养基中，所述人血清的体积分数为20％。

本发明采用的人血清来自自体外周血。制备方法为，自体外周血经400g离心10min后，取上层血清。

本发明中培养基中，所述bFGF的浓度为8ng/mL～12ng/mL；

所述VEGF的浓度为15ng/mL 25ng/mL；

所述IGF的浓度为15ng/mL～25ng/mL；