[发明专利]一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于去势疫苗技术领域，具体涉及一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法。

背景技术

促黄体素释放激素(Luteinizing hormore releasing hormore，LHRH)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，这些激素能促进性腺及性器官的正常发育，维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平，抑制动物性器官发育，使动物丧失性行为和性功能，从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗，促进动物生长，改善胴体组成和肉质，使肉质鲜嫩并防止膻味，提高饲料报酬。其机理是通过LHRH合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后，在体内形成LHRH抗体，中和内源性LHRH，从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平，达到温和去势的目的。与传统手术去势相比，疫苗去势不仅简便易行，给管理者带来极大的方便，尤其适合于规模化养殖和放牧畜群，而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降，另外疫苗去势可适用于大动物或小动物、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物，再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。

但现在并未见有效果较佳的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法，该制备方法简便，成本低，制得的疫苗去势效果较佳，使用方便。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗，其制备方法包括以下步骤：

(1)设计cLHRH基因，序列如下：

P1:5’-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA-3’(SEQ ID NO:1)；

P2:5’-TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC-3’(SEQ ID NO:2)；

(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；

(3)将重组质粒接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，获得原始菌液；

(4)将原始菌液按接种量为2％-3％接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，待菌液OD_600nm值为0.6-0.7时加入终浓度为20-30g/L的乳糖诱导培养5-6h；

(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2-8℃高渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2-8℃低渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，收集上清液；

(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10-1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2-8℃，醛化处理72-76h，得醛化后的蛋白液；

(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温-80，混匀，得水相，其中吐温-80占水相总体积的4％；

将注射用白油与司本-80按体积比为94:6比例，混匀，121℃灭菌60min，得油相；

将油相与水相按2:1比例乳化，制成油包水乳剂，将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制得鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。

进一步地，步骤(4)中乳糖添加量为20g/L。

进一步地，步骤(4)中乳糖诱导时间为6h。

进一步地，步骤(5)中高渗液通过以下方法制备得到：分别称取Tris 484g、EDTA 146g和蔗糖40kg，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用HCl调pH值至8.0，继续添加注射用水至200L，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。