[发明专利]一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计cLHRH基因，序列如下：

P1:5’-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGAACGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGAACTAATGAACTCGAGCA-3’；

P2:5’-TGCTCGAGTTCATTAGTTCGGGCGCAGACCGTAAGACCAATGTTCACCGCCACCCGGCTGCAGGCCGTAAGACCAGAGCTCACCGCCGTTCGGACGCAGACCGTAGGACCAGTGTTCAGCCATGGCC-3’；

(2)对设计的基因序列进行合成、退火、酶切、连接，然后再转入大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；

(3)将重组质粒接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，获得原始菌液；

(4)将原始菌液按接种量为2％-3％接种于含Amp的LB培养基中，于36-37℃，160-250r/min条件下培养，待菌液OD_600nm值为0.6-0.7时加入终浓度为20-30g/L的乳糖诱导培养5-6h；

(5)将步骤(4)诱导培养后的菌液离心，弃上清，得第一沉淀，将第一沉淀置于2-8℃高渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，弃上清，得第二沉淀，将第二沉淀置于2-8℃低渗液中重悬，冰浴10-15min，离心，收集上清液；

(6)将步骤(5)所得上清液用0.22μm膜过滤除菌，然后加入除菌后所得液液1/10-1/5体积的10×醛化盐水，混匀，置于2-8℃，醛化处理72-76h，得醛化后的蛋白液；

(7)将醛化后的蛋白液中加入吐温-80，混匀，得水相，其中吐温-80占水相总体积的4％；

将注射用白油与司本-80按体积比为94:6比例，混匀，121℃灭菌60min，得油相；

将油相与水相按体积比为2:1比例乳化，制成油包水乳剂，将油包水乳剂与1％吐温盐水按体积比为3:7比例乳化，制得鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。

2.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中乳糖添加量为20g/L。

3.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中乳糖诱导时间为6h。

4.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中高渗液通过以下方法制备得到：分别称取Tris 484g、EDTA 146g和蔗糖40kg，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用HCl调pH值至8.0，继续添加注射用水至200L，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。

5.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中低渗液通过以下方法制备得到：分别称取Tris 484g和EDTA 146g，混合，添加适量注射用水，混匀，然后用HCl调pH值至8.0，继续添加注射用水至200L，混匀后于121℃高压灭菌30min，制得。

6.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)中10×醛化盐水通过以下方法制备得到：将氯化钠溶解于注射用水中配成8.75％盐水，以121℃高压灭菌30分钟，冷却后，于每升盐水中加入5ml福尔马林，混合均匀，制得。

7.根据权利要求1所述的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(7)中1％吐温盐水通过以下方法制备得到：向每升注射用水中加入氯化钠9g，吐温-80 10mL，混合均匀，121℃高压灭菌30分钟，制得。

8.采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗。