[发明专利]内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得CCR5^loxp/loxp小鼠，然后与Tie‑2‑cre/ERT2小鼠交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠。本发明的构建方法，通过CRISPR/Cas9系统构建条件性内皮细胞基因敲除小鼠，在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使CCR5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的组织器官，最大限度达到机理研究的可控性，克服了常规基因敲除术不区分不同组织或细胞，在小鼠体内行所有组织或细胞剔除靶基因的弊端。

技术领域

本发明涉及一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，属于动物模型及其应用领域。

背景技术

趋化因子受体CCR5(chemokine receptor 5)是一类G蛋白7次跨膜受体，分子量约为40.6KDa，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：胞外N末端、3个胞外环(extracellular loop)区域(ECL1、ECL2、ECL3)、3个胞内环区域、7个跨膜α螺旋和胞内C末端(Szpakowska M,Perez Bercoff D,Chevigne A.Closing the ring:a fourthextracellular loop in chemokine receptors.Science signaling,2014,7(341):pe21.)，主要表达在单核细胞和某些T细胞亚群。CCR5的配体主要为趋化因子CCL3(chemokine C-C motif ligand 3)、CCL4(chemokine C-C motif ligand 4)和CCL5(chemokine C-C motif ligand 5)。CCR5作为一种G蛋白偶联受体，通过胞外环与配体结合后，使G蛋白上α亚基与β、γ亚基分离，变为激活状态，激活下游信号通路，参与机体生理与病理调节过程如刺激淋巴细胞增生，调节巨噬细胞侵润和MI/M2型极化等。高糖条件下，CCR5在单核/巨噬细胞中表达明显升高，高浓度水平的CCR5可促进巨噬细胞侵润，加重机体炎症反应。长期以来，CCR5一直被看作是调控巨噬细胞迁移、加重糖尿病微血管损伤的重要因子。然而我们前期研究发现：CCR5基因功能性缺失会导致糖尿病患者微血管并发症发病风险增加(Zhang ZW,Zhang XQ,Dong JJ,et al.Association of CCL5/CCR5 genepromoter polymorphisms with diabetic microvascular complications:A meta-analysis.Journal of diabetes investigation,2016,Mar；7(2):212-8.)，我们进一步研究证实，CCR5不仅表达于单核/巨噬细胞中，也特异性表达于内皮/内皮祖细胞中，敲除CCR5虽然能减轻炎症反应，但是也加重了内皮损伤(Zhang Z,Dong J,Lobe C G,et al.CCR5facilitates endothelial progenitor cell recruitment and promotes thestabilization of atherosclerotic plaques in ApoE-/-mice.Stem Cell Research&Therapy,2015,6(1):36.)，而内皮细胞特异表达的CCR5是组织血管再生的重要调节因子。与CCR5基因沉默的细胞相比，表达CCR5基因的内皮祖细胞有更强的促血管生成能力。靶向敲除CCR5会导致内皮祖细胞向受损部位聚集减少，促血管生成因子VEGF表达量降低，皮肤损伤愈合延迟(Ishida Y,Kimura A,Kuninaka Y,et al.Pivotal role of the CCL5/CCR5interaction for recruitment of endothelial progenitor cells in mouse woundhealing.The Journal of clinical investigation,2012,122(2):711-721.)。我们前期研究进一步证实，高糖条件下，小鼠微血管内皮细胞中转染CCR5表达质粒后，细胞促血管新生能力增强，而靶向敲除CCR5后这一促血管新生能力又被明显抑制。上述证据提示CCR5在巨噬/内皮细胞的功能存在异质性，CCR5是介导微血管内皮细胞发挥血管新生功能的关键分子。