[发明专利]内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：首先，获得CCR5 ^loxp/loxp小鼠，然后与Tie-2-cre/ERT2小鼠交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠；

其中，CCR5 ^loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：

（1）将Cas9 mRNA、gRNA和Donor DNA混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割，从而诱发同源重组修复机制以DonorDNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中；

所述gRNA的序列为：

上游靶点：CCR5-L4：GGGTGCTAATTACTGTTCTA；反向互补序列：TAGAACAGTAATTAGCACCC；

下游靶点：CCR5-R：GAAGAAAGTTTTACGGTTGT；

所述Donor DNA的序列如SEQ ID NO.20所示；

（2）上述受精卵移植成功的小鼠出生后，选取雄性的5’端和3’端均有FloxP插入的小鼠，与野生型异性小鼠交配，得到F1代loxp杂合子小鼠；

（3）将上述F1代loxp杂合子小鼠进行相互近交，得到F2代小鼠，从F2代小鼠中选取CCR5loxp纯合子小鼠，CCR5 loxp纯合子小鼠相互近交产生F3代，得到稳定的CCR5 loxp纯合子小鼠品系。