[发明专利]一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过转基因调高玉米抗旱性的方法。

背景技术

玉米是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。随着饲料与工业需求的增加，玉米需求呈强劲地增长态势，当前中国已从玉米净出口转变为玉米净进口。至2011年，玉米的播种面积已超过水稻，成为中国第一大农作物品种(王全忠等，2016)。玉米生长中需水量较大，在整个生长周期内，一般需要至少2500mm的降水量，而且生长期内的需水量变化很大，除苗期可适当干旱(蹲苗)外，从拔节到成熟都应保证良好的水分供应(王士谦，2005)。我国每年种植的玉米面积中，受到干旱影响的面积占了大约60％，造成减产20％-30％(高志勇等，2016)。因此通过玉米抗旱的遗传和生理基础研究，挖掘抗旱相关基因资源，培育高抗旱性玉米品系，对我国玉米生产具有重要意义。

染色质重塑是在维持基因组稳定性、染色质结构和表达调控中起关键作用。Kim等通过染色质免疫共沉淀(ChIP)分析发现，干旱胁迫可诱导RD29A和RD29B基因启动子处核小体密度降低和H3K4me3与H3K9ac修饰的升高，而该区域包含一个关键的胁迫应答因子ABRE(ABA-responsive element)的结合位点，促使胁迫应答转录因子如DREB、ABRE等迅速招募到基因启动子处，激活RD29A和RD29B基因表达；在盐胁迫时，DREB2A、RD29A和RD29B基因的组蛋白H3K9me2水平降低、H3K4me3水平升高，在从而调节了这些基因的表达，以适应胁迫环境(Kim et al.，2008；Kim et al.，2012)。相反的，在同样的条件下，这些相关位点的核小体定位(nucleosome occupancy)急剧下降(Kim et al.，2010)，说明染色质重塑和组蛋白修饰需要密切的协调，从而调控基因表达(tightly coordinated to regulate gene expression)。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种通过转基因调高玉米抗旱性的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通过将CHB101基因的编码区转入到玉米基因组中，在玉米叶片中诱导表达CHB101基因，即然后利用Ubi启动子组成型表达CHB101基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育，提高玉米的抗旱性。具体包括如下步骤：

S1、总RNA的提取：

S11、取4叶期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1ml Trizol，充分混匀，室温放置5-10分钟后，加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5分钟；12,000g 4℃离心15分钟；

S12、从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；

S13、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟后，12,000g 4℃离心10分钟，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)；

S14、室温干燥沉淀2～5分钟，使酒精完全挥发后，用10-15μl DEPC-H2O溶解RNA，视沉淀量而定；

S2、反转录试剂盒购自INVITROGEN公司，实验操作如下：

S21、用DNaseI处理RNA，10μl反应体系包含：

DNaseI 1μl；

DNaseI buffer 1μl；

RNA 10μg；

DEPC-H2O up to 10μl；

轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；

S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：

0.5μg/μl的oligo dTnV 1μl；