[发明专利]一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法。

背景技术

细胞膜上蛋白之间可以相互作用形成寡聚体，这种寡聚化状态对维持细胞信号转导具有十分重要的作用。其中，同源二聚体尤为重要。因此，对细胞膜上存在的同源二聚体分布的观察十分必要。全内反射荧光显微术(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy,TIRFM)在观察细胞膜蛋白分布和运动中有着重要的地位，这种技术只激发距细胞膜表面100-300nm范围内的荧光基团，从而排除了其他荧光信号可能产生的干扰，增强了荧光显微镜在Z轴的分辨率。基于这一技术，科学家发明了全内反射荧光显微镜。已有研究报道了TIRFM可以观察细胞膜上单个蛋白质的分布。但是尚未有报道应用该技术观察植物细胞膜上同源二聚体蛋白的分布情况，原因在于植物含有细胞壁并且标记同源二聚体困难等种种原因。

部分荧光蛋白可以分成两段，这两段分别与两个蛋白相连形成融合蛋白，当连接的两个蛋白相互作用时，荧光蛋白的两段相互靠近，恢复荧光活性，从而发光。这一技术即双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)。

发明内容

本发明的目的是提供一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法。

本发明所提供的观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法，可包括如下步骤：

(a)将目的蛋白的编码基因分别克隆到成对的BiFC表达载体中，得到两个重组表达载体；所述目的蛋白为能够在植物细胞膜上形成同源二聚体的任何蛋白；

(b)将所述两个重组表达载体导入到受体植物的叶片中；

(c)利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察。

进一步地，步骤(a)中，所述成对的BiFC表达载体为成对的BiFC植物双元表达载体。其中，一个携带荧光蛋白的N端的编码基因，另一个携带所述荧光蛋白的C端的编码基因。所述荧光蛋白的N端的编码基因和所述荧光蛋白的C端的编码基因分别与所述目的蛋白的编码基因融合成两个融合基因；当两个融合基因所表达出的两个融合蛋白相互作用(即目的蛋白能够形成同源二聚体)时，荧光蛋白的两段相互靠近，恢复荧光活性，从而发光。

在本发明的一个实施例中，所述荧光蛋白具体为YFP，启动子为CaMV 35S启动子，终止子为NOS终止子。更加具体的，所述成对的BiFC表达载体为pNYE和pCYE。

进一步地，步骤(b)中，所述“将所述两个重组表达载体导入受体植物的叶片”可按照包括如下步骤的方法实现：

(b1)将所述两个重组表达载体分别转化至农杆菌感受态细胞中，得到两种重组农杆菌；

(b2)向所述两种重组农杆菌中分别加入农杆菌侵染缓冲液，调节OD₆₀₀为0.1～0.3，得到两种侵染菌液；

(b3)将所述两种侵染菌液等体积混合，用无针头注射器(规格可为1ml)吸取后抵住所述受体植物叶片背面进行注射，从而实现将所述两种重组表达载体导入所述受体植物的叶片。

更进一步地，在步骤(b1)中，所述两个重组表达载体可通过热激法或者电击法转化至所述农杆菌感受态细胞中。

更进一步地，在步骤(b1)中，将所述两个重组表达载体分别转化至所述农杆菌感受态细胞中后还包括应用PCR技术筛选阳性克隆农杆菌，并培养至农杆菌生长对数期后收集农杆菌的步骤。

更加具体的，所述农杆菌感受态细胞可为GV3101、LBA44044、EHA105或AGL1。进行所述培养时所用的农杆菌培养液具体可为LB培养液(配方：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；pH 7.0)。

更进一步地，在步骤(b2)中，所述农杆菌侵染缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度为：0.5g/100ml D-葡萄糖，50mM MES，2mM Na₃PO₄·12H₂O，pH 5.4。

进一步地，在步骤(b)中，将所述两个重组表达载体导入所述受体植物的叶片后，还可包括对所述受体植物培养24-36小时的步骤。具体的培养条件可为16小时光照/8小时黑暗，22℃恒温。