[发明专利]一种无血清的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法

说明书

本发明提供了一种诱导多功能干细胞冻存液及其冻存方法，其中冻存液由DMEM基础培养基、NEAA、KSR、DMSO和羟乙基淀粉等组成，冻存液成分明确，无动物血清污染，极具应用价值。冻存方法操作简便，不需要反复冻融和现配现用。采用本发明的冻存液及冻存方法冻存的细胞具有细胞活力好，增殖速度快等优点。对促进诱导多功能干细胞研究、建立诱导多功能干细胞库具有重大意义。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种诱导多功能干细胞冻存液以及诱导多功能干细胞冻存方法。

背景技术

诱导的多能干细胞是指将分化的体细胞重编程而获得的多潜能干细胞，具有自我更新及多向分化的潜能，它在干细胞蛋白标记基因和蛋白表达水平、畸胎瘤形成、自我更新潜能和多向分化能力等许多方面类似于胚胎干细胞。诱导多功能干细胞不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等诸多方面的限制，在药物开发、疾病治疗和机理研究方面极具应用价值，是当前全球干细胞研究的热点。

由于多功能干细胞的获得是时间和劳动密集型，而且干细胞的细胞表型会受到传代次数的影响，故在研究过程中经常会涉及到干细胞的冻存。在冻存过程中会显著改变多功能干细胞的热力学、化学和物理环境，对细胞造成损伤，冻存不当甚至会导致细胞死亡。

冻存过程中的影响因素有：细胞浓度、冷冻速率和冻存液。以较高的细胞浓度进行冻存，细胞的存活率更高，冻存速率是以1℃/min的速率进行冻存效果最佳。目前最常用的干细胞冻存液为90％胎牛血清(FBS)+10％二甲基亚砜(DMSO)，或者50％干细胞完全培养基+40％FBS+10％DMSO。DMSO虽然对细胞的穿透力较强，可以降低细胞的冰点，减少冰晶的形成，在降温的过程中能对细胞达到保护作用。但是高浓度二甲基亚砜具有毒性，可以与细胞内蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，造成细胞损伤或者失活。而且现有的冻存液由于使用动物源的血清导致细胞冻存液中参入非人员物质，会对多功能干细胞造成残留或者污染。

为获得无动物源污染、数量大的诱导多功能干细胞，并建立多功能干细胞库，研究开发出一种无动物外源成分、对细胞损伤较小并能够长久保存多功能干细胞的冻存液及冻存方法，对诱导多功能干细胞的研究具有重要意义。

发明内容

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非另外说明，本文中的iPSCs为诱导多功能干细胞的英文简称，DMSO为二甲基亚砜的英文简称，KSR为血清替代品的英文简称，DMEM为基础培养基的英文简称。

除非另外说明，本文中的多功能干细胞和细胞均指诱导多功能干细胞。

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、无动物外源成分、细胞存活率更高的诱导多功能干细胞冻存液及冻存方法。

本发明的一个目的是提供一种诱导多功能干细胞的冻存液。

本发明所述的冻存液由A液和B液组成。A液与B液的体积比为1:1。

所述的A液100mL中含有0-3％β-巯基乙醇、0-5％白血病抑制因子、0-4％的NEAA、0-4％的L-谷氨酰胺、0-5μM CHIR99021、0-5μM PD0325901、38-55％的KSR和40-58％的DMEM。

优选地，所述的A液100mL中含有0.5-2％β-巯基乙醇、0.5-2％白血病抑制因子、0.3-3％的NEAA、0.3-3％的L-谷氨酰胺、1-4μM CHIR99021、1-4μM PD0325901、40-50％的KSR和45-55％的DMEM。

更优选地，所述的A液100mL中含有0.8％β-巯基乙醇、0.8％白血病抑制因子、1％的NEAA、1％的L-谷氨酰胺、2μM CHIR99021、1μM PD0325901、45％的KSR和51.4％的DMEM。