[发明专利]一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及饮用水领域，具体涉及一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。

背景技术

目前，市面上销售的天然矿泉水品种繁多，但品质参差不齐，很多所谓的矿泉水并非取自地下深层水源和山泉，而只是在地表水的基础上进行了加工，微生物含量超标严重，长期饮用危害消费者健康。因此，天然矿泉水中微生物的检测是一项重要的监测指标，它反映出水体受微生物污染的情况，关系矿泉水的水质能够达到直接饮用的标准。传统的微生物检测方法检测周期长，精度不高，难以满足现代企业和质量检测部门的要求。所以，有必要探究天然矿泉水微生物检测新技术。

传统的矿泉水微生物检测方法主要有：总菌计数法、多管发酵法、平板计数法。这些传统的微生物检测方法的最大优势在于测试成本较低，操作难度低。缺点在于测试周期长，往往需要 3～5 d 才能形成肉眼可见的菌落，而且对无菌环境的要求较为严格，测定结果受培养环境的影响较大。同时，传统的微生物检测方法只能检测活菌数量，不能用于检测水体中总微生物数量。总体来说，目前内源性ADP的去除方法有效性差，检测矿泉水中微量的大肠杆菌的方法灵敏度低，传统的微生物检测方法的检测结果准确性不高。

因此，有必要发明一种新型的矿泉水中微生物的检测方法，以此来适应于市场有关行业的需求，这将大大的推动我国微生物检测及饮用水行业的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前内源性ADP的去除方法有效性差，检测矿泉水中微量的大肠杆菌的方法灵敏度低，提供了一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：

一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该制备方法包括如下步骤：

（1）将大肠杆菌菌株接种至LB培养基中，培养，离心收集菌丝，向菌丝体中加入Tris-HCl溶液，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴，离心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入异丙醇，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，将大肠杆菌基因组DNA模板溶于水，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；

（2）在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl₂、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均匀后，得混合液，将混合液加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；

（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清液，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；

（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP混合，得混合物A，将混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads-apyrase 继续孵育，得去内源ADP融合蛋白产物；

（5）将AMP，PolyP，MgCl₂，Tris-HCl，PPK-ADK混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液混合，反应，得反应物，将反应物调节pH，向微量ATP扩增反应液中加入ATP，水浴，得反应液，将反应液加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中大肠杆菌菌株与LB培养基的质量比1:9，培养条件为35~37℃培养18~24h，菌丝体与Tris-HCl溶液的质量比1:10，菌丝混合液与NaCl，EDTA的质量比为2:50:1，上清液与NaAC的体积比为2:3，上清混合液与异丙醇的质量比为1:1，大肠杆菌基因组DNA模板与水的质量比为1:9。