[发明专利]一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法

权利要求书

1.一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

将大肠杆菌菌株接种至LB培养基中，培养，离心收集菌丝，向菌丝体中加入Tris-HCl溶液，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴，离心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入异丙醇，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，将大肠杆菌基因组DNA模板溶于水，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；

在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl₂、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均匀后，得混合液，将混合液加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；

将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清液，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；

（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP混合，得混合物A，将混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads-apyrase 继续孵育，得去内源ADP融合蛋白产物；

（5）将AMP，PolyP，MgCl₂，Tris-HCl，PPK-ADK混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液混合，反应，得反应物，将反应物调节pH，向微量ATP扩增反应液中加入ATP，水浴，得反应液，将反应液加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中大肠杆菌菌株与LB培养基的质量比1:9，培养条件为35~37℃培养18~24h，菌丝体与Tris-HCl溶液的质量比1:10，菌丝混合液与NaCl，EDTA的质量比为2:50:1，上清液与NaAC的体积比为2:3，上清混合液与异丙醇的质量比为1:1，大肠杆菌基因组DNA模板与水的质量比为1:9。

3.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，

ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，

ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，

ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。

4.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl₂、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9。

5.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中融合蛋白PPK-ADK与polyP的质量比为3:1，孵育条件为35~37℃孵育10min。

6.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.5~1h，得固相腺苷酸双磷酸酶。