[发明专利]一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，本发明通过测试不同建库技术，优化反应流程，建立了一种可以检测低至1ng严重降解基因组DNA的甲基化建库技术。通过测试不同酶组合，实现了降解DNA的末端修复、3端加A和DNA双链由于降解形成缺口的修复，在同一反应体系中完成；通过优化反应体系，实现在原反应液中连接测序接头；进一步测试接头生物素标记后，通过生物素和链霉素磁珠的特异性结合，实现后续亚硫酸盐处理前已连接接头基因组片段的钓取，减少目的片段的丢失；此外还优化建立亚硫酸盐反应体系和反应时间，降低处理过程中DNA的损伤，保证甲基化转换率，实现微量降解样本的甲基化建库和测序。

技术领域

本发明涉及基因组学和分子生物技术领域，尤其涉及一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法。

背景技术

DNA甲基化5mC是甲基转移酶(DNAmethyltransferase，MTase)介导的甲基供体S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)分子中的甲基基团转移到DNA胞嘧啶上的过程。在真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸胞嘧啶的5碳位上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA的甲基化修饰涉及动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，对基因的表达调控起重要作用。DNA甲基化修饰紊乱为胚胎异常发育、癌症发病机制的探索提供了新思路。为满足不同科研需求，在过去数十年中，已建立多种DNA甲基化检测方法，如甲基化胞嘧啶消化分离结合高效液相色谱法、毛细管电泳法，基于生物亲和蛋白结合荧光标记显色或免疫显色的甲基化检测技术等，均可分析DNA整体甲基化水平，但无法得知每一个位点的甲基化情况。

随着高通量测序技术的发展，DNA亚硫酸盐测序可以精确检测每一个碱基的甲基化水平，被誉为DNA甲基化检测的“金标准”。常规基因组DNA甲基化测序前建库构建需要微克级别，至少几百纳克的无降解、无污染完整的基因组DNA，建库流程包括：(1)基因组超声打断；(2)打断产物纯化浓缩；(3)片段化产物末端修复；(4)纯化回收；(5)修复产物3’端加“A”；(6)纯化回收；(7)加A产物连接“C”位点甲基化修饰的接头；(8)纯化回收；(9)亚硫酸盐处理及纯化回收；(10)文库PCR扩增；(11)纯化及质控等十多步骤的操作。由于操作步骤的繁琐，增加了DNA的起始量，微量DNA无法进行全基因组甲基化检测。此外，亚硫酸盐处理过程中，对于DNA的损伤及其严重，90％以上的DNA将发生断裂和片段化，进一步导致已连接测序接头的大部分片段无法正常测序，这又进一步增加了所需要的起始DNA量。

上述建库方法除了DNA起始量的要求高外，更难以应用到严重降解样品DNA的甲基化建库测序。而实际上，除了科研探索对于微量DNA甲基化技术有需求外，临床痕量样本甲基化检测技术的建立也亟需解决。体内组织DNA的提取只能采取侵入式采集，这种方式不仅操作麻烦还有可能对人体造成严重伤害。研究发现，组织来源DNA除了存在于体内，还存在于动物和人的体液中，目前在外周血、脑脊液，唾液、支气管灌洗液、胸腹腔积液、胃液、胆汁中均可检测到循环游离DNA(cfDNA)，同样可以检测到病灶组织来源的游离DNA，例如来源于肿瘤组织的循环肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)，这为疾病的预防和控制提供了理想的检测靶标。然而，临床病理检测的穿刺组织在福尔马林浸泡，石蜡包埋处理后(FFPE样本)及人体静脉外周血、粪便、尿液等分离的胞外游离DNA(cfDNA)含量极低，通常只有几纳克，且均存在严重降解的情况，部分DNA已降解到100bp以下。对于该类样品的基因组DNA甲基化建库测序技术或相关试剂盒产品少有报道。