[发明专利]一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，方法步骤如下：

S1：将提取的DNA样品用超纯水或EB缓冲液进行洗脱，样品洗脱体积不超过30uL；

S2：DNA末端修复、3’端加A及降解缺口修复：基因组DNA片段在Repair Buffer和RepairEnzymes的作用下，分别在16-42℃、20-40min；75℃、25min；72℃、10-60min，37℃，10min四个阶段进行反应，20℃保存，分别进行DNA的末端修复、3’端加A及双链DNA降解缺口的修复；

S3：修复DNA片段的接头连接及钓取：在上述反应体系中，分别加入连接Buffer A、Buffer B、甲基化和生物素共同修饰的接头及DNA连接酶，15-24℃反应10-30min，进行接头连接，连接产物通过链霉素标记的M280钓取连接接头的DNA片段，产物重悬至超纯水中；

S4：亚硫酸盐处理，非甲基化C碱基转换：在回收产物中加入亚硫酸盐保护剂和增强剂和亚硫酸盐转换液，98℃反应5min，54℃反应1小时，加入300uL的Binding buffer进行柱纯化，产物脱磺酸基后洗脱到超纯水中；

S5：PCR扩增、质控和测序：对于亚硫酸盐转换的DNA为模板，采用扩增酶形成稳定的PCR扩增反应体系；PCR产物经0.9X磁珠纯化，质控合格后进行测序；

S6：测序数据质控及分析：下机数据分别进行去接头，低质量值reads过滤和统计，甲基化转换率统计，比对及比对率统计，基因组覆盖度统计，重复率统计，计算每一位点甲基化水平；

所述S2中Repair Enzymes包括DNA Polymerase I、T4 DNA Polymerase、KlenowFragment、Klenow Fragment(exo-)、T4 Polynucleotide Kinase、PCR polymerase、Bst和T4 DNA ligase、Taq polymerase；

所述S2中Repair Enzymes为T4 Polynucleotide Kinase、T4 DNA Polymerase和Taqpolymerase，且浓度分别为8U、2U、0.04U；

所述S3中Buffer A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP，且浓度分别为190mM、27mM、14mM、7mM；Buffer B包括PEG6000和PEG8000，PEG6000的浓度为30％，PEG8000的浓度为20％。

2.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S1中样本DNA的使用量≥1ng。

3.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S2中Repair Buffer的成分包括MgCl2、NaCl、DTT、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Tris-HCl，且浓度分别为10mM、50mM、5mM、4mM、1mM、1mM、1mM、60mM，所述Tris-HCl的pH值为7.6。

4.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S5中的扩增酶为taq酶或高保真酶。

5.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S5中的扩增酶为taq酶。