[发明专利]虾虹彩病毒(SIV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种虾虹彩病毒（SIV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种虾虹彩病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

虹彩病毒科病毒形成二十面体病毒粒子，直径120～300nm，具有线性双链DNA基因组，基因组大小约102～212kbp，在细胞质中进行复制。虹彩病毒含有丰富的主要衣壳蛋白(MCP)，蛋白区域高度保守，通常被用来鉴定不同的物种。虹彩病毒科最近被划分为5个属：虹彩病毒属(Iridovirus)，绿病毒属(Chloriridovirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，蛙病毒属(Ranavirus)和肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)。虹彩病毒宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。其中无脊椎虹彩病毒(invertebrateiridescent viruses，IIVs)主要感染昆虫和陆生两栖类动物，到目前为止关于IIVs在甲壳纲、十足目中的报道较少，尤其是以螃蟹为研究对象。

目前，对虾类虹彩病毒的检测主要有电镜观察、常规组织学方法、免疫组织化学法和原位杂交，但这些技术分别使用时，却各有局限性。电镜观察法耗时长，费用高并且需要具备特殊的实验器材且视野较窄；组织病理观察不太适用与早期检测，通常在病毒严重感染机体全身，产生明显的、不可逆转的组织病变时，方可得到确证；免疫组织化学法和原位杂交操作相对比较繁琐，灵敏度不高，且不嫩对病毒进行定量研究。现在也常用的PCR-电泳法，但操作复杂。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供虾虹彩病毒(SIV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种虾虹彩病毒(SIV)核酸的检测试剂盒，包括：虾虹彩病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述虾虹彩病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述虾虹彩病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。