[发明专利]利用枯草芽孢杆菌制备D‑阿洛酮糖差向异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属。革兰氏阳性菌，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色，需氧菌。

D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D- 阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，早期的D-阿洛酮糖合成方法是通过多级化学转化普通单糖或非糖的前体物质，但多次的保护和脱保护操作会导致收率偏低，且合成过程繁杂，存在很大的局限性。目前，虽已有以D-果糖为原料，可通过生物转化法制备D-阿洛酮糖的报道，但是目前已报道的微生物，产生的D-阿洛酮糖差向异构酶转化能力仍较差，且分离纯化过程较难。

中国专利文献CN106434494A(申请号201611095535.7)公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY 005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13152。本发明还涉及该枯草芽孢杆菌的培养方法与应用。本发明首次获得的高产D-阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌BLCY-005，其发酵液中的D-阿洛酮糖差向异构酶酶活可达到143U/ml，较传统D- 阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.5～6.5，与传统菌株产D-阿洛酮糖差向异构酶最适pH偏中性相比，有利于生产中对污染的控制。

萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，简称NAA，是一种有机化合物，是一种易溶于有机溶剂的无色固体。它的结构为萘的1号位置以羧甲基取代。它是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。但目前未有用于微生物培养的相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，可显著降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2。

根据本发明优选的，所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。

利用枯草芽孢杆菌制备D-阿洛酮糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：

(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，进行种子培养，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比1～2％的接种量接种于上述发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；

(3)取步骤(2)制得的发酵液，经离心分离、洗涤菌体，再经干燥、粉碎，制得D- 阿洛酮糖差向异构酶干粉。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13152。