[发明专利]具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌

说明书

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及由其构建的基因工程菌。其中，突变菌株在16％乙醇和20％甲醇冲击条件下的存活率比出发菌株分别提高了3.74倍和2.10倍；过表达来自突变菌株的groEL、dnaK、recA、uvrD、katG、sod或treS基因的工程菌对高浓度有机溶剂的耐受能力均明显提高，并对盐压力和氧化压力也表现出更高的耐受能力，上述工程菌应用于甾体C1,2脱氢反应可将体系中乙醇浓度提高至8‑10％，底物CA浓度提高至6‑8g/L，产物产量提高0.41‑3.56倍，为后续的耐性机制研究和菌株分子改造与应用奠定了良好基础。

技术领域：

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及由其构建的基因工程菌。

背景技术：

甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物。甾体化合物C1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。与化学合成方法相比，微生物转化反应具有高度的立体选择性和区域选择性，能够大幅度的减少合成步骤，缩短生产周期。但是，底物的难溶性(一般为10^-5-10^-6mol/L)和水相的催化环境使得底物与生物酶不能有效接触，进而直接影响了催化反应的速率和效率。研究者采用很多方法提高底物的溶解度，如底物微粒化、环糊精包合、浊点系统和离子液体等，这些方法有的操作繁琐，有的成本较高。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。为了突破这一瓶颈，迫切的需要解析转化反应菌株在有机溶剂胁迫条件下的适应机制，并在此基础上创建适用于工业化应用的高有机溶剂耐性的微生物菌株。

近年来，研究者在微生物有机溶剂适应行为和耐性机制方面开展了大量的工作，主要集中在革兰氏阴性菌，且多以模式菌株(如大肠杆菌)为研究对象。而且表现出明显的菌株特异性和溶剂特异性。更为重要的是，工业菌株与实验室广泛研究的模式微生物在遗传背景和生理特性上存在着一定差异，这种异质性也是全面解析调控机制的重要瓶颈。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)以专一性高、反应速率快等优点已成为工业生产中广泛使用的甾体C1,2脱氢反应菌株，同时反应体系中多采用添加有机溶剂的方法(一般是乙醇)促进疏水性底物的溶解。目前对于简单节杆菌在有机溶剂胁迫条件下的适应行为和耐受分子机制尚未展开系统研究。菌株有机溶剂耐受性的水平还存在较大的局限性，有待于通过诱变育种、分子生物学等技术进一步提高。

本发明通过紫外-亚硝酸钠复合诱变结合压力驯化的方法选育出一株具有较高乙醇耐受性能的简单节杆菌突变株TCCC11307-UV15X1-2。比较蛋白质组学的研究发现，热激蛋白GroEL，DnaK；DNA重组修复蛋白RecA，DNA解旋酶UvrD；过氧化氢酶KatG，超氧化物歧化酶SOD；海藻糖合成酶TreS是与简单节杆菌乙醇耐受性相关的重要蛋白。在此基础上，采用分子生物学技术分别构建系列过表达工程菌株。本发明为揭示简单节杆菌胁迫条件下的耐性分子机制奠定了良好的基础，为甾体C1,2位脱氢反应高效菌株的创建提供新思路。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供多株具有胁迫耐受性的简单节杆菌菌株，这些菌株在高浓度有机溶剂和底物的C1,2位脱氢反应体系中表现出更好的胁迫耐受性和生物转化能力。

本发明实现上述目的的技术方案之一，是提供一株具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变株，所述突变株具体为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11307-UV15X1-2，保藏编号CGMCC No.14539，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。