[发明专利]一种将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检测的用途及其检测方法

说明书

本发明属于医学生物检测技术领域，尤其涉及将单磺酸四氮唑盐用于微生物检测的用途及方法；利用新型单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物试剂无毒、可与微生物共孵育、有颜色变化的特点实时监测细菌，提供了一种快速细菌性质的检测方法；检测试剂选用EZMTT单磺酸四氮唑盐检测体系，在活细菌数量上呈现良好的线性剂量关系；测试剂通过单磺酸四氮唑盐反应物在450nm的吸光度值，得到EC₅₀曲线，进行细菌活力评价。

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，尤其涉及将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检测的用途及方法。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。对人类致病的有人型结核杆菌和牛型结核杆菌，非典型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。

结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，大小约1～4×0.4um，呈单个或分枝状排列，有荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用齐-尼式钠氏(Ziehl-Neelsen)抗酸性染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性有关。结核杆菌的检测方法不多，传统的直接检测法有平板涂片，革兰阴性、荧光染色法、抗酸染色法、显微镜观察等等，间接的有PCR检测法，荧光免疫法等等，操作步骤繁多，检测复杂，时间长，成本高等等。

因此，临床诊断主要根据结核菌感染的类型，采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰(最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰)；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。

(一)直接涂片染色

咯痰可直接涂片。用萋～纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，因标本中可能混杂有非致病性抗性抗酸杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。如标本中结核杆菌量少，杂菌和杂质多时，直接涂片不易检出(一般需要每毫升痰液含有结核杆菌10万个以上才能检出)，应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。

无菌直接采取的脑脊液、导尿或中段尿可直接用离心沉淀集菌。咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂功菌多，需用4％NaOH或3％HCL或6％H₂SO₄处理，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。

(二)分离培养

结核杆菌生长缓慢，培养期长，当以酸碱中和浓缩集菌的沉淀物，接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。根据生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色象菜花状，菌体染色抗酸性强，多数为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型，则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。

(三)动物试验

常用豚鼠或地鼠鉴别凝似结核杆菌的分离培养物和毒力测定。取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3～4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检：若观察6～8周后，仍未见发病者，也要剖检。剖检时应注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。