[发明专利]一种小球藻的保藏方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻保藏技术领域，更具体地说，本发明涉及一种小球藻的保藏方法。

背景技术

小球藻属(Chlorella)是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorcoccales)、小球藻科(Chlorellaceae)。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻

(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和微小小球藻(Chlorella minutissima)等。小球藻的应用价值很高，有“绿藻中的黄金”的美誉。已广泛应用于水体净化、食品添加剂、动物饲料以及医药保健等领域。

小球藻单细胞藻种的保藏一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。目前，小球藻保藏方法主要有液体保藏法、固体平板保藏法和超低温保藏法等。液体保藏法和固体平板保藏法保藏时间往往较短(通常为1-2个月)，由于培养基表面易干燥，需要定期传代，但是频繁的传代不仅增加了人力成本和污染的风险，而且易导致藻种优良性状的退化或丢失。超低温保藏法虽然保藏时间较长，但需要昂贵的设备、耗能大、保存条件苛刻，且保存液中需要添加对藻体细胞有毒性作用的抗冻剂，因此难以得到普遍应用。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有小球藻保藏中存在的上述问题，提供一种操作简便、成本低、不易污染、保藏效果好、保藏时间长的、可最大限度保持小球藻生物活性的保藏方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种小球藻的保藏方法，其包括如下步骤：

将处于对数生长期的、无杂菌的小球藻滴于加了琼脂平板培养基的培养容器中，振荡使其分散，然后放置于温度22～26℃、光照度4000～6000lx的光照培养箱中24h连续光照培养5～10d，再用封口膜密封、倒置、低温弱光照保藏；

其中，所述琼脂平板培养基由如下步骤制备得到：

(1)制备每升含有土壤浸提液30～50mL、NaHCO₃ 0.5～1.0g、KNO₃ 1.0～1.5g、KH₂PO₄ 0.8～1.0g、琼脂15～20g、余量为水、pH为8.0～8.5的溶液，灭菌得到A液；

(2)制备每升含有100～160g的山梨糖醇溶液，经过滤除菌，得到B液；

(3)在A液凝固前加入B液，B液的加入体积为A液体积的1/200，得到混合液；

(4)将所述混合液加入到培养容器中，紫外光照射15～20min，凝固后得到琼脂平板培养基。

作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，所述处于对数生长期的小球藻是将小球藻加入到盛有生长培养基的容器中，在光照度4000～6000lx、24h连续光照、温度22～26℃、150～180rpm条件下振荡培养5～7d得到；

所述生长培养基，每升含有葡萄糖2.0～3.0g、蛋白胨0.8～1.0g、K₂HPO₄·3H₂O 0.4～0.6g、MgSO₄·7H₂O 0.8～0.9g、NaCl 0.4～0.6g、MnCl₂·4H₂O 0.008～0.01g、AlCl₃0.008～0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.009～0.01g、余量为水，pH为7.0～8.0。

作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，所述培养容器为96孔培养板，所述的将混合液加入到培养容器中是将150～200μL的混合液加入到96孔培养板中。

作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，每100mL所述土壤浸提液由如下步骤制备得到：采集地表以下10～20cm深处的土壤10g，加水100mL，煮沸30min，冷却后4000rpm离心20min，取上清液，加水至100mL，得到土壤浸提液。

作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，步骤(2)中，所述过滤除菌为0.22μm滤膜过滤除菌。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：