[发明专利]一种通过花药培养获得簇毛麦纯合再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，是一种通过花药培养获得簇毛麦加倍单倍体再生植株的方法。

背景技术

簇毛麦(Haynaldia villosa,2n＝14,VV)是小麦族簇毛麦属二倍体种，具有许多重要的农艺性状，其高抗白粉病，兼抗叶锈病、秆锈病、全蚀病、眼斑病、小麦条斑病毒的传媒瘿螨、叶枯病和大麦黄矮病等多种病害，簇毛麦籽粒蛋白质和赖氨酸含量高，兼有分蘖力强、耐寒、抗旱、密穗多花等特性，是目前世界上小麦品种改良不可多得的优良基因资源库，因此，研究簇毛麦对于小麦的育种、改良研究工作的发展具有十分重要的意义。

有报道在普通小麦与硬粒小麦-簇毛麦(AABBVV,2n＝42)双二倍体杂种培养中的细胞和再生植株中，通过组织培养诱导了小麦与簇毛麦染色体之间的易位(李洪杰,等.组织培养创造抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位及分子标记辅助选择.遗传学报,2000,27(7):608-613)，表明利用组织培养技术可以将簇毛麦中的优良基因导入到普通小麦栽培种，但针对簇毛麦本身组织培养研究还相当少。花药培养技术是一种常用的获得单倍体再生植株的方法，经过染色体加倍可以获得所有性状一次纯合的加倍单倍体植株，但该技术的应用在很大程度上受到培养材料本身的基因型限制，难以获得再生植株。目前还未见通过花药培养获得簇毛麦再生植株的报道。

簇毛麦为一年生或多年生异花授粉的野生植物，具有一定的杂合性，影响簇毛麦遗传学研究和大规模基因组测序开展。本发明针对以上技术上的不足，以簇毛麦花药为研究对象，建立了一套适合簇毛麦的花药培养技术，能简单、快速、稳定获得簇毛麦的纯合加倍单倍体植株，避免了研究中的野生簇毛麦的杂合问题。更为重要的是有利于提高簇毛麦-小麦远缘杂交种的花药培养效率，以期加速簇毛麦野生优良基因资源在小麦遗传改良中的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种适合簇毛麦的花药培养技术。

本发明的第一方面，提供一种通过花药培养获得簇毛麦纯合再生植株的方法，包括以下步骤：

A)选取小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，4-7℃低温预处理3-21d；

B)步骤A中预处理后的簇毛麦幼穗用10-15％NaClO处理10-15min，无菌水冲洗后釆取花药置于含甘露醇50-70g/L(优选60g/L)，添加1.0-1.2g/LCaCl₂、0.9-1.0g/L MES和0-30mg/L(优选20mg/L)秋水仙碱，pH 5.5-6.0的提取液中24-26℃，暗处理2天；换入添加麦芽糖75-105g/L(优选90g/L)、谷氨酰胺1000-2000mg/L(优选1600mg/L)、水解酪蛋白100-600mg/L(优选400mg/L)、10-30mg/L(优选20mg/L)脯氨酸、KT 0.5-1.5mg/L(优选0.5mg/L)、2,4-D 0.5-2.0mg/L(优选1.0mg/L)，pH5.5-6.0的N6诱导培养基中培养，诱导愈伤组织形成；

C)步骤B中的愈伤组织转入添加20-40g/L麦芽糖(优选30g/L)、0.5-1.5mg/L(优选0.5mg/L)6-BA、1.0-3.0mg/L(优选1.5mg/L)KT、0-0.1mg/L(优选0.05mg/L)NAA、4-6g/L琼脂粉，pH 5.5-6.0的2/3MS分化培养基中培养；待再生芽长至2-4cm时，转入添加蔗糖20-40g/L(优选30mg/L)、谷胱甘肽0-200mg/L(优选100mg/L)、NAA 0.05-1.0mg/L(优选0.6mg/L)、矮壮素0.3-6mg/L(优选0.5mg/L)、4-6g/L琼脂粉，pH 5.5-6.0的1/2MS壮苗生根培养基中培养，获取根、茎、叶完整的再生植株。

优选的，所述的步骤A中，所述的小孢子发育处于单核早-中期的幼穗一般是指簇毛麦幼穗叶耳距为±2cm时的幼穗，此时小孢子发育时期处于单核早-中期的数目较多且活力较佳，是取材的最佳时期。

本发明的材料幼穗取材特性是簇毛麦幼穗叶耳距为±2cm时，小孢子发育时期处于单核早-中期的数目较多且活力较佳，是取材的最佳时期。叶耳距过长时，虽小孢子活力有所提高，但小孢子发育时期已过，材料偏老，不适合簇毛麦花药培养；叶耳距过短时，小孢子发育时期还未处于单核早-中期或处于该时期的数目较少，亦不适合簇毛麦花药培养。而大麦取材是旗叶抽出2-4cm时，选取单核靠边期的幼穗。