[发明专利]一种可用于曼氏无针乌贼与金乌贼种间鉴定的分子标记及应用

说明书

技术领域

本发明属于乌贼物种鉴定技术领域，尤其涉及一种可用于曼氏无针乌贼与针乌贼种间鉴定的分子标记及应用。

背景技术

我国东海海域主要的乌贼种类有曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)和金乌贼 (Sepia esculenta Hoyle)均称为墨鱼，乌鱼，隶属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、二鳃亚纲(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、乌贼超科(Sepiacea)、乌贼科 (Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)，是我国近海重要的捕捞品种。两者均营养价值好并且具有一定的药用价值；其肉洁白如玉，具有鲜、嫩、脆的特点，营养丰富，每百克肉含蛋白质13克、脂肪0.7克以及丰富的钙、磷、铁。除鲜食外，还可加工制成罐头食品或干制品。乌贼的干制品南方叫螟蛹誊，北方叫墨鱼干，雄性生殖腺干品叫乌龟穗，雌性缠卵腺于品叫乌鱼蛋，均为海味佳品。虽两者外部特征较为接近，但其市场价值相差较大，因此，选用有效的方法来区分曼氏无针乌贼和金乌贼则具有重要意义；近年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学手段来鉴定物种已经逐渐成为一种趋势，并为大多数的生物学家所接受。目前最常见的是应用线粒体COI基因及ITS序列差异作为区分不同物种的分类依据，但是这些基因序列之间的区别往往是SNP或者是In/de l，不同物种之间序列长度的变化并不明显，因此难以应用电泳等方法区别不同物种；测序可以取得这个基因或者序列的详细碱基信息，但是测序实验过程比较繁琐，花费也较高，并且需要大型仪器的支持，很难在短时间内实现准确、快速、简单的物种鉴定。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种可用于曼氏无针乌贼与金乌贼种间鉴定的分子标记。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分曼氏无针乌贼与金乌贼种间鉴定的应用。

本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分曼氏无针乌贼与金乌贼种间鉴定的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该可用于曼氏无针乌贼与金乌贼种间鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记的正向引物F1为 5'CAGGAACAGTTTCCACTACCCCTAC 3'；反向引物F2为5'CGCGTACATATCGCCCGTC 3'。

本发明为解决第二个技术问题提供一种利用上述SNP分子标记在基于高分辩率溶解曲线鉴定曼氏无针乌贼与金乌贼中的应用。

进一步地，所述曼氏无针乌贼目标扩增片段中的SNP为： CAGGAACAGTTTCCACTACCCCTACTATGTTACGACTTATCTTATTTTATCAACAAGAG CGACGGGCGATATGTACGCATTACAAAACCAAAACA。

进一步地，所述金乌贼目标扩增片段中的SNP为：

CAGGAACAGTTTCCACTACCCCTACTATGTTACGACTTATCTTATTTTACCAACAAGAG CGACGGGCGATATGTACGCGCTATAAAACCTGATTC。

本发明为解决第三个技术问题提供一种基于高分辨率溶解曲线鉴定曼氏无针乌贼与金乌贼的方法，其特征在于：

以曼氏无针乌贼与金乌贼基因组DNA为模板，根据曼氏无针乌贼与金乌贼的基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分；以待鉴定乌贼基因组DNA为模板，根据乌贼的基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分乌贼相近物种。

进一步地，通过上述扩增获得的PCR产物，添加核酸饱和染料后变性处理，冷却至室温进行HRM测定。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、方法简单易行；不需要测序，直接通过扩增片段的Tm值来反应DNA水平上的区别而区分不同物种；

2、结果明确直观；不用进行序列比对等步骤，不同物种之间DNA水平的差异以直观的峰图形式表现出来，极易区分辨别；

3、准确有效；本发明鉴定方法采用高分辨率熔解曲线(HRM)具有分辨单个核苷酸差异的能力，能够准确反映DNA水平上的差异，使得鉴定结果准确可靠，与测序结果相比较准确率为100％；