[发明专利]一种可检测NF‑κB活化的双荧光素酶报告细胞及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能检测NF-κB活化的双荧光素酶报告细胞及其构建方法。

背景技术

转录因子NF-κB是存在于低等到高等哺乳动物所有细胞非常保守的信号分子，在细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和自身免疫病等多种细胞活动中发挥重要作用^[1,2]。NF-κB家族由P50(P105的处理产物，两者都被称为NF-κB1)，P52(p100的处理产物，两者都被称为NF-κB2)，REL(也被称为c-REL)，REL-A(也被称为P65)和REL-B组成(图1)。这些蛋白质二聚化后形成有功能的NF-κB。除了REL-B只能与P50或P52有效的结合外，存在所有的同源或异源二聚体组合的可能性，并且这些不同的二聚体都具有NF-κB的活性。每一个NF-κB家族的成员都有一个保守的REL同源区(RHD)，它包含三种类型的基序：结合特异性DNA序列的基序；二聚化的基序；和一个核定位的基序(NLS)。P50型的NF-κB1及P52型的NF-κB2包含仅仅一个RHD，而REL、REL-A、和REL-B除包含一个RHD外，还包含一个转录活化区(TD)(图1)。在没有刺激的细胞中，大部分的NF-κB二聚体通过与细胞质中三个抑制因子(IκBα、IκBβ、IκBε)中的一个结合而以无活性的状态存在(图1)。这些抑制因子通过它们的锚蛋白区与NF-κB二聚体结合，掩盖至少一个核定位基序(NLS)。其中原型抑制因子IκBα，除阻止其结合的二聚体与DNA结合外，还通过其末端的一个氨基末端输出序列促进NF-κB二聚体的出核作用而解除NF-κB的活化^[1,2]。

多种信号包括多种病原的组分例如脂多糖(LPS)，前炎性细胞因子，如TNF、IL-1及丝裂原等都可以活化NF-κB途径；各种信号通过降解抑制因子IκBs的方式来活化NF-κB，活化的NF-κB然后进入细胞核内与DNA结合。依赖IκB激酶(IKK)降解IκBs的NF-κB活化途径被称为经典NF-κB活化途径；IKK是由一个调节亚单位，IKK-γ(也被称为NEMO)和两个催化亚单位IKK-α，IKKβ组成。首先IKK接受上游信号活化并磷酸化IκBα上两个保守的丝氨酸残基，然后IκBα在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下发生多泛素化而被蛋白酶降解(图2)。NF-κB二聚体的抑制因此解除，发生活化并转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录(图2)。释放后的NF-κB可以通过例如修饰自身亚单位的方式来影响自身的转录激活效能：活化的NF-κB快速诱导IκBα编码基因的转录，新合成的自由IκBα进入细胞核内，然后使DNA上NF-κB解离并且将NF-κB排出细胞核，从而恢复到静息状态^[3]。非经典NF-κB活化途径依赖于NF-κB inducing kinase(NIK)和IKKα，接受上游特定信号后，NIK和IKKα磷酸化NF-κB2前体蛋白p100，使之酶切产生成熟的p52。P52和REL-B形成二聚体，核转位并激活一组不同于经典NF-κB活化基因的表达^[4]。

常见的报告基因有以下几种^[5,6,7]：(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。一般通过底物反应比色法检测酶活性。(3)荧光蛋白家族：荧光蛋白发射荧光可被荧光显微镜或相关仪器检测。(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。(4)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶。哺乳细胞中常用的是萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLuc)和海肾荧光素酶(renilla luciferase,RLuc)^[7,8]。萤火虫荧光素酶(FLuc)灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报告基因，获得了广泛的应用。