[发明专利]一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗领域，尤其涉及一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，具体适用于促红细胞生成素修饰神经干细胞移植对实验性大鼠脑梗死缺血灶修复作用的分析。

背景技术

缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。有四种类型的脑缺血：短暂性脑缺血发作(TIA)；可逆性神经功能障碍(RIND)；进展性卒中(SIE)；完全性卒中(CS)。TIA无脑梗死存在，而RIND、SIE和CS有不同程度的脑梗死存在，对发病初期的脑缺血患者应给予积极的内科治疗，目的在于阻止脑缺血的进一步发展。减轻脑损害。应根据患者不同病因、发病机制、临床类型、发病时间等情况确定治疗方案，给予个体化治疗。然而，现有对缺血性脑卒中的治疗，不能有效地促进脑缺血恢复期神经功能的恢复，导致治疗效果差。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有对缺血性脑卒中的治疗，不能有效地促进脑缺血恢复期神经功能的恢复，导致治疗效果差；现有技术由于受到理念所限，目的基因表达的蛋白收技术所限不能有一定丰度的表现，所以改进并以期显著的表达是很必要的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法。本发明通过转基因病毒载体可以有效地显示目的基因蛋白的丰度。目的基因包括EPO基因和LacZ基因。

本发明是这样实现的，本发明遵循基因表达理念，双重基因表达丰度强于单一基因表达，所表达底物可以更好发挥生物学效益。

本发明提供一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，包括：

步骤一，从新生大鼠前脑组织中分离NSC，利用流式细胞仪和单细胞克隆技术，通过体外培养扩增显示其自我更新和多潜能分化的特性，并且经过rAAV介导EPO基因和LacZ基因转移，建立稳定表达EPO基因和LacZ基因的NSC转染系统并分析NSC转染系统在体外、体内表达转基因蛋白状况；

步骤二，将经EPO基因和LacZ基因修饰的NSC转染系统移植入大鼠脑梗死缺血灶，分析EPO基因和LacZ基因对大鼠脑梗死缺血灶的修复作用；并进一步分析经EPO基因和LacZ基因等基因修饰的干细胞对大鼠脑梗死的治疗机制。

进一步，所述从新生大鼠前脑组织中分离NSC包括：

NSC的原代培养：

(1)取材：24h内新生SD乳鼠，脱颈椎处死，75％酒精浸泡消毒、剥除颅骨及脑膜，在解剖显微镜下分离出前脑组织；

(2)消化：采用机械消化法，将脑组织在培养皿上锐性切割，转移至10ml细胞离心管，加入PBS至3ml，小心吹打后静置2min，吸出并收集上清液，在含有沉淀组织的离心管中加入相同体积的PBS液，再次吹打，如此反复，使组织体积逐渐减小；

(3)离心：75g离心10min或900转/min离心5min；弃上清液；加入NSC培液，吹打均匀，细胞计数并将浓度调整为1*10⁶/ml；

(4)培养：将细胞悬液转移至24ml细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

进一步，所述从新生大鼠前脑组织中分离NSC还包括：

传代：

当50％细胞团块>30个细胞时进行传达；将细胞悬液转移至10ml离心管，以110g离心10min，弃上清液。加入2ml培养液；轻柔吹打后静置5min，转移上清液至培养瓶；离心管中再加入2ml培液，重复操作至细胞团块消失；

消化后的细胞悬液细胞计数并将浓度调整为1*10⁶/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

连续传代大于18次，直至去除所有死细胞、细胞碎片和不规则细胞团块，形成规则的神经球。

进一步，流式细胞仪的筛选包括：

Heochst33342染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存，悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst33342，终浓度为1ug/ml；37℃孵育1h后，低温500-1000r/min离心5min弃去染液，用PBS洗2次后保存在冰中；然后使用流式细胞分离SP细胞。

进一步，所述单细胞克隆包括：

采用有限稀释法稀释细胞悬液后转移至96孔板中；

分析并选择含有单个细胞的培养孔；

置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，挑选生长活跃形成神经球的细胞进行传达，扩增培养。