[发明专利]一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法

权利要求书

1.一种验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法包括：

步骤一，从新生大鼠前脑组织中分离NSC，利用流式细胞仪和单细胞克隆技术，通过体外培养扩增显示其自我更新和多潜能分化的特性，并且经过rAAV介导EPO基因和LacZ基因转移，建立稳定表达EPO基因和LacZ基因的NSC转染系统并分析NSC转染系统在体外、体内表达转基因蛋白状况；

步骤二，将经EPO基因和LacZ基因修饰的NSC转染系统移植入大鼠脑梗死缺血灶，分析EPO基因和LacZ基因对大鼠脑梗死缺血灶的修复作用；并进一步分析经EPO基因和LacZ基因等基因修饰的干细胞对大鼠脑梗死的治疗机制。

2.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述从新生大鼠前脑组织中分离NSC包括：

NSC的原代培养：

(1)取材：24h内新生SD乳鼠，脱颈椎处死，75％酒精浸泡消毒、剥除颅骨及脑膜，在解剖显微镜下分离出前脑组织；

(2)消化：采用机械消化法，将脑组织在培养皿上锐性切割，转移至10ml细胞离心管，加入PBS至3ml，小心吹打后静置2min，吸出并收集上清液，在含有沉淀组织的离心管中加入相同体积的PBS液，再次吹打，如此反复，使组织体积逐渐减小；

(3)离心：75g离心10min或900转/min离心5min；弃上清液；加入NSC培液，吹打均匀，细胞计数并将浓度调整为1*10⁶/ml；

(4)培养：将细胞悬液转移至24ml细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述从新生大鼠前脑组织中分离NSC还包括：

传代：

当50％细胞团块>30个细胞时进行传达；将细胞悬液转移至10ml离心管，以110g离心10min，弃上清液。加入2ml培养液；轻柔吹打后静置5min，转移上清液至培养瓶；离心管中再加入2ml培液，重复操作至细胞团块消失；

消化后的细胞悬液细胞计数并将浓度调整为1*10⁶/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

连续传代大于18次，直至去除所有死细胞、细胞碎片和不规则细胞团块，形成规则的神经球。

4.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，流式细胞仪的筛选包括：

Heochst33342染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存，悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst33342，终浓度为1ug/ml；37℃孵育1h后，低温500-1000r/min离心5min弃去染液，用PBS洗2次后保存在冰中；然后使用流式细胞分离SP细胞。

5.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述单细胞克隆包括：

采用有限稀释法稀释细胞悬液后转移至96孔板中；

分析并选择含有单个细胞的培养孔；

置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，挑选生长活跃形成神经球的细胞进行传达，扩增培养。

6.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述rAAV介导EPO基因和LacZ基因转移的方法包括基因转导的引物的设计与合成、扩增以及rAAV-EPO和rAAV-LacZ的表达。

7.如权利要求1所述的验证治疗脑梗死缺血药物药性的大鼠模型构建方法，其特征在于，所述建立稳定表达EPO基因和LacZ基因的NSC转染系统包括：

克隆培养的NSC转染系统以2*10⁶/ml密度置于10cm培养皿中，并加入2*10^10urAAV-EPO或rAAV-LacZ，转染12h后转换为新的培养液，继续进行培养72h。