[发明专利]氟噻唑吡乙酮抗性基因RORP1作为卵菌转化筛选标记的应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体公开了氟噻唑吡乙酮抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。本发明通过将可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上抗性的突变蛋白的编码基因作为筛选标记，用于卵菌转化时转化子的筛选，且经实验验证，转化子筛选的阳性率可达100％。将该氟噻唑吡乙酮抗性基因作为筛选标记用于卵菌的遗传转化实验，以氟噻唑吡乙酮作为筛选药剂，具有筛选效率高、筛选阳性率高、应用范围广、成本低等显著优点，同时，该筛选标记的开发解决了卵菌转化时筛选标记单一、筛选效率低等问题，为卵菌转化时基因回补、基因多敲除等方面的工作提供了有力保障。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的卵菌转化筛选标记。

背景技术

卵菌主要包括水霉目和霜霉目，可引发多种植物或动物病害。19世纪40年代，卵菌中的致病疫霉(Phytophthora infestans)曾引起爱尔兰饥荒，对欧洲乃至整个世界造成了严重的冲击，对人类文明产生了巨大影响。

卵菌虽然在形态上与真菌非常相似，但是随着分子生物学技术的不断发展，人们逐渐发现，其与真菌及动物的亲缘关系较远(Latijnhouwers et al.,2003；Jiang andTyler,2012)。除了基因组亲缘关系较远，卵菌与真菌的差别还表现在多个方面(Judelson,2005)。例如，在基因组大小方面，卵菌基因组的大小一般在50-250Mb之间，而真菌基因组大小通常介于10-40Mb；在染色体组成方面，卵菌生活史的主要阶段均为二倍体，而真菌在生活史的营养生长阶段主要以单倍体、双核体或多核体的形式存在；在细胞壁的组成方面，卵菌细胞壁的主要成分是纤维素(β-1,4-葡聚糖)，而真菌细胞壁的主要成分是几丁质(β-1,4-N-乙酰基葡萄糖胺)；在基础代谢方面，卵菌一般不能合成甾醇，甾醇类物质对卵菌营养生长也不是必需的，而真菌体内可以合成甾醇，其甾醇合成终产物麦角甾醇对真菌的生存具有重要意义。

卵菌与真菌之间的多种差异，尤其是因为卵菌主要以二倍体的形式存在，导致真菌中常用的通过基因重组对靶标基因进行敲除的方法很难在卵菌中应用。

在卵菌基因敲除体系建立之前，人们通常通过向卵菌生物体内引入外源片段来实现靶标基因的沉默或过表达。但是该方法由于沉默/过表达效率不可控、转化子不稳定、外源片段易丢失等问题，使其在实际应用中受到很大的限制。Lamour等在2006年首先在大豆疫霉中建立TILLING(Targeted induced local lesions in genomes)体系，但是由于TILLING技术存在靶向性不强且卵菌基因冗余造成的筛选难度系数高等问题，限制了其在基因功能研究中的广泛应用(陈孝仁和王源超,2012)。锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶相关技术的发展也为基因的定点突变奠定了基础，但是由于操作复杂、成本高等原因受到应用限制。近期发展起来的CRISPR(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat sequences)基因编辑技术为基因功能的研究提供了有力工具。2016年，Brett M.Tyler教授课题组利用CRISPR技术验证了效应因子Avr4/6在大豆疫霉和寄主互作过程中的功能(Fang and Tyler,2016)。在具体操作过程中，CRISPR技术的大致步骤如下：首先根据靶标基因设计向导RNA(sgRNA)，构建sgRNA表达载体，同时构建Cas9蛋白表达载体和同源臂载体，最后通过原生质体转化的手段将三个载体同时导入靶标菌，对靶基因进行敲除。