[发明专利]氟噻唑吡乙酮抗性基因RORP1作为卵菌转化筛选标记的应用

权利要求书

1.氟噻唑吡乙酮抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用，其特征在于，所述氟噻唑吡乙酮抗性基因编码卵菌中的氧化固醇结合蛋白1，并使所编码的蛋白相对于野生型蛋白ORP1，在第769位发生氨基酸的突变，由甘氨酸突变为色氨酸，导致卵菌对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上抗性；所述氟噻唑吡乙酮抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；所述卵菌为大豆疫霉(Phytophthora sojae)或荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：将所述氟噻唑吡乙酮抗性基因连入含有卵菌通用启动子的转化载体，用于卵菌遗传转化的筛选。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛选为以其他筛选标记基因筛选获得的敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或用于以其他筛选标记基因筛选获得的卵菌敲除转化子中其他基因的再敲除的转化筛选。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将卵菌菌株的靶标基因替换为传统筛选标记基因NPTⅡ，获得靶标基因被敲除的转化子；

S2、根据NPTⅡ基因，设计靶向NPTⅡ基因的sgRNA，并构建sgRNA表达载体；

S3、将所述氟噻唑吡乙酮抗性基因RORP1连入上述sgRNA表达载体，得到带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的sgRNA表达载体；

S4、以S1所述的靶标基因被敲除的转化子为实验材料，获得原生质体，通过PEG-CaCl₂介导的方法向原生质体中同时转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的sgRNA表达载体、Cas9蛋白表达载体和同源臂载体；经筛选获得阳性转化子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S4中的筛选方法为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药V8平板，进行第三次筛选。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度介于0.005-0.25μg/mL之间。

7.一种卵菌转化的筛选方法，其特征在于，以氟噻唑吡乙酮抗性基因作为筛选标记进行卵菌转化子的筛选；所述氟噻唑吡乙酮抗性基因编码卵菌中的氧化固醇结合蛋白1，并使所编码的蛋白相对于野生型蛋白ORP1，在第769位发生氨基酸的突变，由甘氨酸突变为色氨酸，导致引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上抗性；所述氟噻唑吡乙酮抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；所述卵菌为大豆疫霉(Phytophthora sojae)或荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)。