[发明专利]一种石斛多倍体成苗诱导方法

说明书

技术领域：

本发明涉及石斛多倍体技术领域，具体涉及一种石斛多倍体成苗诱导方法。

背景技术：

多倍体是指体细胞具有2个以上染色体组的植物，是植物新品种培育的重要手段，由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点。目前石斛主要采用离体培养条件下，诱导体细胞染色体加倍的方式获得。通过基因组三倍化，可以获得具有多倍体和杂交种双重优势的三倍体，可以提高石斛的药材产量、品质和抗逆性，也有利于商业保护。目前的石斛多倍体的培育方法存在变异范围窄、新品种选育频率低的问题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种石斛多倍体成苗诱导方法，培育出的三倍体霍山石斛茎、叶、花明显增大，产量与糖含量明显提高，抗逆性增强，具有多倍体和杂交种的双重优势。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

一种石斛多倍体成苗诱导方法，包括以下步骤：

(1)选取抗逆性好、生长快、茎杆粗、纤维含量低、药效成分含量高的霍山石斛品种作为多倍体培育的二倍体霍山石斛；

(2)将二倍体霍山石斛按照常规方法进行栽培管理，在开花后的5～10天内进行同株异花授粉，授粉后的霍山石斛植株，放置通风、半透光条件下，保持湿度30～50％、温度22～28℃，直至蒴果形成；

(3)剪下蒴果，在无菌工作台内用85％酒精消毒3～5min，再使用0.1～0.3wt％的升汞水溶液消毒5～10min，无菌蒸馏水冲洗3～5遍，沿蒴果纵轴切开，将二倍体石斛种植接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡后萌发培养30～50天得到二倍体植株；

(4)将四倍体愈伤组织进行诱导分化，获得四倍体植株幼苗；常规炼苗驯化栽培至开花得到四倍体植株；

(5)将二倍体植株与四倍体植株人工授粉杂交、结果，且互为父本和母本，即得到三倍体霍山石斛种子；

(6)将三倍体霍山石斛种子进行播种，待长出幼苗后，置自然光下炼苗5～10天，然后放置在20～30℃、75～85％的湿度下培养，得到三倍体霍山石斛成苗。

优选地，所述步骤(3)萌发培养的条件为室温25℃，光周期14小时/天，光强度3000Lux。

优选地，所述步骤(4)多倍体愈伤组织的诱导分化是将其移入含有0.01％秋水碱的1/2MS固体培养基中，诱变处理150～180小时。

优选地，所述步骤(5)二倍体植株与四倍体植株在花期人工授粉杂交。

本发明的有益效果是：本发明的石斛多倍体成苗诱导方法，通过将二倍体霍山石斛与诱导后的四倍体愈伤组织培育成的四倍体植株进行人工授粉杂交，“基因组多倍化与杂交相结合的方法”来培育石斛多倍体复合体，与现有的方法相比，茎、叶、花明显增大，产量与糖含量明显提高，抗逆性增强，具有多倍体和杂交种的双重优势。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

一种石斛多倍体成苗诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取抗逆性好、生长快、茎杆粗、纤维含量低、药效成分含量高的霍山石斛品种作为多倍体培育的二倍体霍山石斛；

(2)将二倍体霍山石斛按照常规方法进行栽培管理，在开花后的6天内进行同株异花授粉，授粉后的霍山石斛植株，放置通风、半透光条件下，保持湿度30～50％、温度22～28℃，直至蒴果形成；

(3)剪下蒴果，在无菌工作台内用85％酒精消毒4min，再使用0.1wt％的升汞水溶液消毒8min，无菌蒸馏水冲洗3遍，沿蒴果纵轴切开，将二倍体石斛种植接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡后萌发培养40天得到二倍体植株；其中，萌发培养的条件为室温25℃，光周期14小时/天，光强度3000Lux。

(4)将四倍体愈伤组织进行诱导分化，获得四倍体植株幼苗；常规炼苗驯化栽培至开花得到四倍体植株；

(5)将二倍体植株与四倍体植株在花期人工授粉杂交、结果，且互为父本和母本，即得到三倍体霍山石斛种子；

(6)将三倍体霍山石斛种子进行播种，待长出幼苗后，置自然光下炼苗10天，然后放置在25℃、80％的湿度下培养，得到三倍体霍山石斛成苗。

实施例2

一种石斛多倍体成苗诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取抗逆性好、生长快、茎杆粗、纤维含量低、药效成分含量高的霍山石斛品种作为多倍体培育的二倍体霍山石斛；