[发明专利]一种表面修饰S‑层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及壳聚糖微球的制备领域，特别涉及一种S-层蛋白修饰壳聚糖微球的制备方法和应用，具体为乳酸菌的S-层蛋白修饰的壳聚糖微球及其在功能性食品和药品领域的应用。

背景技术

壳聚糖是一种带正电荷的天然多糖，无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用、无溶血效应，具有良好的生物相容性、生物降解性、生物黏附性和促进药物吸收的作用。将壳聚糖制成载药微球，能够控制药物释放速度，降低药物的毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性，改善药物的稳定性和改变给药途径，延长药物疗效以及靶向给药等。近年来，已有多种药物实现了壳聚糖微球作为缓释控释载体，并实现了在胃、结肠、肝、肾等部位给药，在生物医学领域表现出良好的应用前景。

乳酸杆菌S-层蛋白作为已知最小的S-层蛋白，可作为S-层蛋白结构和功能的研究模型，其显著的结晶特性、基因的可修饰性以及S-层晶格空间结构特性，在生物技术、纳米科技和生物医药等方面有着巨大的应用前景。乳酸杆菌作为益生菌，利用S-层蛋白的启动子或基因序列进行外源蛋白的表达、抗原表位的展示等应用，为生物安全基因工程疫苗的研究开辟了一条新途径。此外，乳酸菌的S-层蛋白的生物拮抗作用备受人们的关注，但其机制还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用。通过S-层蛋白在壳聚糖表面修饰，不仅能够使得壳聚糖微球在体内作用更长时间，控制药物释放，同时利用S-层蛋白的益生功能，提高壳聚糖微球的功能特性。

本发明制备S-层蛋白壳聚糖微球的方法简单、可行、质量可控，且制备出来的S-层蛋白修饰壳聚糖微球的粒径小，具有广大的市场应用价值。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种S-层蛋白修饰壳聚糖微球，所述壳聚糖微球是以壳聚糖为载体，戊二醛为 交联剂，以Span-80为乳化剂，环己烷为油相，通过乳化交联法制备的，并通过 乳酸菌S-层蛋白进行修饰，其中，S-层蛋白与壳聚糖微球的质量比为1:1.2～1.9。

具体制备方法包括以下步骤：

（1）乳酸菌S-层蛋白提取：收集乳酸菌在MRS培养基中生长至对数期的菌体，洗涤后与LiCl/GuHCl溶液先后混合孵育，离心收集上清后得S-层蛋白提取物；

（2）乳酸菌S-层蛋白纯化：采用SP Sepharose(HP)柱对步骤（1）中S-层蛋白粗提物进行分离纯化；

（3）乳酸菌S-层蛋白鉴定：采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定步骤（2）中纯化后的S-层蛋白的序列；

（4）壳聚糖微球制备：将壳聚糖物质加入适量体积及浓度醋酸溶液中，配置成壳聚糖溶液，按5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比称取相应质量的5-氟尿嘧啶投放到上述醋酸溶液中，搅拌使其溶解后，慢慢加入到含有Span-80与环己烷的锥形瓶中，充分搅拌后，维持一段时间，按比例加入戊二醛继续反应，分离产物，洗涤，冷冻干燥后，得到壳聚糖微球；

（5）乳酸菌S-层蛋白修饰壳聚糖微球：将步骤（2）中纯化的S-层蛋白和步骤（4）中制备的壳聚糖微球分别溶于磷酸盐缓冲液，两者混合后在一定条件下孵育，离心弃去上清，得S-层蛋白修饰壳聚糖微球；

（6）S-层蛋白修饰壳聚糖微球性状观测：采用光学显微镜观察形状、大小和初步的分布，之后用激光粒度分析仪和扫描电镜进行粒度分析；

（7）S-层蛋白修饰壳聚糖微球的体外释放检测：制备包埋5-氟尿嘧啶的S-层蛋白修饰壳聚糖微球，分别称取适量的5-氟尿嘧啶粉末，壳聚糖微球和S-层蛋白修饰壳聚糖微球，置于含有5 mL的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液的透析袋中，紧密封口，然后分别置于200 mL的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液中，以100 r/min的速率恒温震荡，定时取5 mL的释放介质在265 nm测定其紫外吸光度，同时补充等量释放液，根据标准曲线计算浓度，并绘制累计释药率-时间曲线。

优选的，步骤（1）中所述乳酸菌为携带S-层蛋白的乳酸菌，包括嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、卷曲乳杆菌的一种或多种。