[发明专利]一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法。

背景技术

甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来，具有催化活性的部分伸向充满胶质滤泡腔的内部。TPO作为甲状腺激素在生物机体内合成过程中的一种重要酶，能参与催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的偶联过程，最终生成甲状腺素(T3、T4)。TPO同时也是甲状腺微粒体的主要抗原组成成分，当生物体甲状腺发生病变，导致滤泡细胞的生物结构受到破坏时，TPO随即经过甲状腺滤泡细胞腔的边缘部分即甲状腺细胞顶部的部位向外周血进行遗漏，从而刺激机体进行免疫系统调节，免疫系统随即产生TPO抗体(TPO-Ab)以应对刺激。

人体自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)的发病机理是由T细胞介导的器官特异自身免疫性疾病，其生物学特征是患者血清内会产生针对甲状腺抗原的多种自身抗体。甲状腺过氧化物酶抗体就是其中最重要的一种，普遍存在于自身免疫性损伤的甲状腺疾病中，血清中甲状腺过氧化物酶抗体水平的测定，是对自身免疫性甲状腺疾病高危人群筛查、诊断和治疗的有效手段。因此，TPO-Ab水平的检测可以用于对AITD等甲状腺疾病的诊断、治疗和愈后观察。对于AITD的诊断，TPO-Ab检测较甲状腺微粒体抗体(TM-Ab)检测更加灵敏、特异和可靠，是诊断AITD的一项必不可少的实验室指标，TPO-Ab含量的高低目前在国际上已成为AITD的一常规检测项目。对原发性甲状腺机能减退的患者，结合hTSH升高情况，可以发现早期甲状腺机能减退病人。TPO-Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴别诊断的生化首选检测指标。所以，对TPO的高效、低成本表达进行研究显得尤为重要。

目前国内使用的TPO抗原都来自进口，其价格大约为10000元/mg，不但成本较高，而且往往购买周期较长，无法满足临床的需求。而且有关TPO制备的文献报道也十分稀少，因TPO抗原具有分子量大，糖基化、磷酸化等蛋白质翻译后修饰过程十分丰富等特点，导致原核表达系统无法表达出高活性的TPO蛋白，目前只能使用蛋白表达量相对较低的传统杆状病毒表达系统进行表达，成本十分昂贵，严重阻碍了这种检测方法的大规模应用。因此，提高杆状病毒表达系统生产TPO蛋白的表达量对TPO蛋白研究和应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM-IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。

进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，提高细胞活率是指利用极晚期启动子polh驱动杆状病毒反式激活因子IE0/1的表达。

进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，延长蛋白表达时间是指利用嵌合启动子HPP替换晚期启动子p10来驱动甲状腺过氧化物酶基因的表达。

进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，具体包括以下步骤：

1)TC表达框的构建：

利用融合PCR构建嵌合启动子HPP，所述嵌合启动子HPP包括转录增强序列hr1、杆状病毒强启动子p10和p6.9；利用PCR方法分别获得IE0基因、IE1基因，然后以重叠PCR方法将IE0基因和IE1基因融合为IE0/1基因，利用常规酶切克隆方法将IE0/1基因克隆于pFBDM-IG转移载体的polh启动子下游，将嵌合启动子替换p10启动子，获得含有TC表达框的杆状病毒转移载体pFBDM-TC-IG；

2)转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建：

将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到正确的pFBDM-TC-TPO-IG；

3)Tn7位点的转座：