[发明专利]一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法

权利要求书

1.一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM-IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。

2.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，提高细胞活率是指利用极晚期启动子polh驱动杆状病毒反式激活因子IE0/1的表达。

3.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，延长蛋白表达时间是指利用嵌合启动子HPP替换晚期启动子p10来驱动甲状腺过氧化物酶基因的表达。

4.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)TC表达框的构建：

利用融合PCR构建嵌合启动子HPP，所述嵌合启动子HPP包括转录增强序列hr1、杆状病毒强启动子p10和p6.9；利用PCR方法分别获得IE0基因、IE1基因，然后以重叠PCR方法将IE0基因和IE1基因融合为IE0/1基因，利用常规酶切克隆方法将IE0/1基因克隆于pFBDM-IG转移载体的polh启动子下游，将嵌合启动子替换p10启动子，获得含有TC表达框的杆状病毒转移载体pFBDM-TC-IG；

2)转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建：

将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到正确的pFBDM-TC-TPO-IG；

3)Tn7位点的转座：

制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μL pFBDM-TC-TPO-IG质粒，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃220rpm振荡培养，然后用TPO特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；

4)重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：

将构建的pFBDM-TC-TPO-IG/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染Sf9细胞：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍；将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后观察荧光检测是否感染成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；

5)甲状腺过氧化物酶表达量的检测：

收集病毒感染的Sf9细胞，离心收集上清，用RIPA细胞裂解液将细胞沉淀裂解，然后以细胞上清和细胞沉淀为样品分别做ELISA检测。

5.根据权利要求4所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述步骤1)中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表达。