[发明专利]一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域，涉及一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法。

背景技术

Y染色体具有遵循父系遗传、单倍型完整等特点，对探究哺乳动物父系遗传多样性、群体遗传结构、迁徙路线、起源和进化等问题具有重要的科学价值。家牛(包括普通牛和瘤牛)Y染色体单核苷酸多态位点(Y-SNPs)的研究表明：家牛由3种Y染色体单倍型组构成，包括Y1和Y2两种普通牛单倍型组和Y3瘤牛单倍型组( et al.2005,Ginja et al.2009)。然而，在当前国内外家牛Y染色体单倍型组构成的研究中，研究者大多采用存在于Y染色体标记上的多个Y-SNPs的联合定型分析来确定各家牛品种的单倍型组构成，进而对其父系支系组成和起源做出推断(Ginja et al.2010,Pérez-Pardal et al.2010,Cortés et al.2011,Edwards et al.2011,常振华2011,Li et al.2013a,Li et al.2013b,Zhang et al.2013,Yue et al.2014)，这种联合定型的方法耗时耗力、费用相对较高，在一定程度上影响家牛Y染色体单倍型组构成的检测效率。

为了能够快速准确、经济可靠的确定这3种单倍型组在不同家牛品种内的分布状况，进而揭示其群体父系遗传结构和起源，Bonfiglio等(2012)基于Y染色体USP9Y(Y-linked Ubiquitin-specific Protease 9)基因内含子26上1个81bp的插入和1个限制性酶切位点发展出了一种只借助于PCR扩增和酶切电泳就可以鉴别这3种家牛单倍型组的方法。然而，该方法虽然提高了检测效率，但是需要借助酶切分析，操作相对繁琐，不够简便，检测耗时也较长。除上述研究之外，目前尚未见其他简单可行、快速准确、费用较低的鉴别这3种家牛单倍型组的方法报道。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，该方法能够快速简便、省时省力、经济可靠地确定家牛品种的Y染色体单倍型组成，结果准确可靠，能够提高家牛品种的父系支系组成检测效率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，包括以下步骤：

1)样品采集和基因组DNA提取

采集待检测牛的血样或耳组织，提取待检测牛的基因组DNA，备用；

2)引物合成和PCR扩增

以家牛Y染色体ZFY-10标记引物序列合成1对引物，以步骤1)提取的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中：

上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

3)测序、单倍型组定型分析

将步骤2)获得的待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序，测序引物为扩增引物，得到待检测牛的ZFY-10标记测序序列结果，进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点，依据该标记的核苷酸变异位点确定单倍型组类型；

在测定的序列比对中：

若待检测牛所测序列中存在GT缺失，则直接判定该头牛属于普通牛Y1单倍型组，此时SNP位点为C核苷酸；

若待检测牛所测序列中不存在GT缺失，则看SNP位点的C>T核苷酸类型，如果SNP位点为C核苷酸，则判定该头牛为普通牛Y2单倍型组，反之，如果SNP位点为T核苷酸，则判定为Y3瘤牛单倍型组。

优选地，本发明方法可以同时检测多头牛的Y染色体单倍型组构成，只需要分别采集血样或耳组织提取基因组DNA，然后进行引物合成和PCR扩增，测序、分析比对后进行单倍型组的构成判断和确认。

优选地，步骤1)中，采用基因组DNA提取试剂盒提取待检测牛的基因组DNA，稀释至终浓度为25～50ng/μL，备用。

优选地，步骤2)中，PCR扩增的反应体系共计25μL，包括：

优选地，步骤2)中，PCR扩增时反应程序为：98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸10s，重复35个循环后冷却至4℃保存。

优选地，步骤2)中，扩增长度为286bp。

优选地，步骤3)中，将待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序后，将测序结果用Chromas 2.6.4软件进行核实，得到每头公牛的ZFY-10标记测序序列结果。