[发明专利]一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法

权利要求书

1.一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品采集和基因组DNA提取

采集待检测牛的血样或耳组织，提取待检测牛的基因组DNA，备用；

2)引物合成和PCR扩增

以家牛Y染色体ZFY-10标记引物序列合成1对引物，以步骤1)提取的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中：

上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

3)测序、单倍型组定型分析

将步骤2)获得的待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序，测序引物为扩增引物，得到待检测牛的ZFY-10标记测序序列结果，再进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点，依据该标记的核苷酸变异位点确定待检测牛的单倍型组类型；

在测定的序列比对中：

若待检测牛所测序列中存在GT缺失，则直接判定该头牛属于普通牛Y1单倍型组，此时SNP位点为C核苷酸；

若待检测牛所测序列中不存在GT缺失，则看SNP位点的C>T核苷酸类型，如果SNP位点为C核苷酸，则判定该头牛为普通牛Y2单倍型组，反之，如果SNP位点为T核苷酸，则判定为Y3瘤牛单倍型组。

2.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤1)中，采用基因组DNA提取试剂盒提取待检测牛的基因组DNA，稀释至终浓度为25～50ng/μL，备用。

3.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增的反应体系共计25μL，包括：

2×PrimeSTAR Max Premix 10.5μL；

上游引物 0.5μL；

下游引物 0.5μL；

模板DNA 1μL；

超纯水 12.5μL。

4.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增时反应程序为：98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸10s，重复35个循环后冷却至4℃保存。

5.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤2)中，扩增长度为286bp。

6.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤3)中，将待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序后，将测序结果用Chromas 2.6.4软件进行核实，得到每头公牛的ZFY-10标记测序序列结果。

7.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法，其特征在于，步骤3)中，采用BioEdit 7.2.5软件进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点。