[发明专利]牛源性成分检测试剂盒

权利要求书

1.牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，包含引物组合和膜芯片，引物组合为4重聚合酶链式反应引物组合，在每条反向引物的5’端进行生物素修饰，各对引物的碱基序列5’-3’如下：

16S rRNA：正向引物：GACCTCGATGTTGGATCAGGAC

反向引物：GATAGAAACCGACCTGGATTG

黄牛 D-loop：正向引物：AACACAGAATTTGCACCCT

反向引物：ATTAAGCTCGTGATCTAATGGT

水牛 D-loop：正向引物：CTGACTTTACACTCTAGCCTA

反向引物：GGATTTGACTTGAATGCACT

牦牛 D-loop：正向引物：CTAACAACACACATCCCCAA

反向引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA

膜芯片为顺序固定在支持膜表面的4组探针序列和一组阳性对照探针序列，探针5’末端需进行Amino linker C12修饰，4组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：

16S rRNA探针: GATTAATAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGC

黄牛 D-loop探针: GACCACAGAATGAATTACCTACGCAAGGGGTAATG

水牛 D-loop探针: CAACATATGACCCTACTACTCCGAATGGGGG

牦牛 D-loop探针: GCATTGTCCAAACGGGGGATACGTACA

阳性对照探针：

GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG。

2.如权利要求1所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述引物组合中每对引物中修饰的引物与非修饰引物含量比值为3:2。

3.如权利要求1或2所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述牛源性成分检测试剂盒包含引物组合、膜芯片和辅料，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸、EX-Taq聚合酶和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为：

biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。

4.如权利要求3所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述牛源性成分检测试剂盒包含引物组合、膜芯片、辅料和配液，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺显色液。

5.如权利要求4所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液；其中，SSC为0.75M 氯化钠, 0.075M柠檬酸钠，Denhardt’s液为1% Ficoll聚蔗糖， 1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；杂交液为5×SSC，0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s液，50%重量百分比去离子甲酰胺和100μg/mL 酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4；其中，洗液1为2×SSC和0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2为0.5×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3为100 mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，洗液4为100 mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl和100mM MgCl₂；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为 3%重量百分比的H₂O₂用800体积的双蒸水稀释液。

6.如权利要求1所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于；所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。