[发明专利]一种莱克多巴胺特异性免疫亲和层析色谱胶及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种莱克多巴胺特异性免疫亲和层析色谱胶，由保藏编号CCTCC NO.C2014127杂交瘤细胞株分泌的单抗蛋白经纯化再与CNBr‑activated Sepharose^TM 4B胶化学交联形成固相化抗体而获得。本发明选用针对莱克多巴胺具有高灵敏度和强特异性识别与结合的单抗，将其作为核心试剂应用于免疫亲和层析胶研制中，其产品对目标物同样具有高选择性、高亲和力等特性；以此作为新型机测样本前处理模式能有效去除待测样本的基质干扰，获得高回收率、高纯度目标物供HPLC‑FLD以及LC‑MS/MS作确证和精确定量分析；与传统固相萃取前处理模式比较发现，这种新型前处理模式在操作便捷性、样本净化通量、目标物回收率、机测峰型等指标优于传统理化前处理，拓展了HPLC‑FLD/LC‑MS/MS检测莱克多巴胺残留样本的应用领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺强特异性免疫亲和层析色谱胶及其制备方法和应用。

背景技术

莱克多巴胺作为第二代瘦肉精药物代表，与恶名昭彰的第一代瘦肉精 药物盐酸克伦特罗相比，具有残留半衰期短、易形成代谢物、原药残留比 例低、极易逃避有效检测等特点。莱克多巴胺成为兽药残留监测最重要的 目标物之一。另外，美国以及一些南美国家允许在猪、牛、羊、火鸡饲料 中限量添加莱克多巴胺，因而从美国进口的肉类食品中莱克多巴胺残留成 为我国海关必检项目。因此建立一套完整且行之有效的快速筛查配合确证 以及精确定量的检测技术，是有效控制国内莱克多巴胺滥用以及解决国际 贸易争端的必由之路。

自2000年美国FDA首次批准莱克多巴胺作为猪、牛、羊、火鸡的饲料添加剂用以提高饲料转化率和瘦肉率以来，对于莱克多巴胺检测技术的建立与优化已经成为相关学者以及食品安全监管部门关注的焦点。间接竞争ELISA法和以免疫胶体金测试条作为主要检测模式的免疫快检技术，以样本处理简单、检测成本低、检测通量高、无需大量昂贵仪器设备和专业培训人员等优势已成为莱克多巴胺残留高通量快速定性筛查或半定量分析不可替代的技术手段。近十年来，以北京维德维康为代表的许多国内生物技术公司先后研发了莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒、莱克多巴胺免疫胶体金检测卡以及盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三联免疫金标卡等多种针对莱克多巴胺残留的快检产品并得到了广泛应用，为有效控制莱克多巴胺滥用发挥了巨大作用。

尽管上述快检产品能对待测样本中莱克多巴胺的原药残留量或者是原药+莱克多巴胺体内代谢物总残留量是否超标作较明确定性的界定，但对阳性样本中具体组分的界定以及各组分的精确定量仍需借助高效液相色谱配荧光检测器(HPLC-FLD)或液质串联色谱(LC-MS/MS)等技术作确证和精确定量分析。

为此，农业部于2008年制定了莱克多巴胺残留的确证和精确定量测定国标方法—《动物源性食品中β-受体激动剂测定—液相色谱串联质谱法》 (农业部1025号公告-18-2008)，并沿用传统理化方式作前处理，其过程不仅有蛋白质和脂肪等大分子基质的去除，也有目标物的液相和固相两步萃取，更有目标物溶解体系两步更替等步骤。这些处理不仅需 Waters/Agilent等国际知名公司提供的优质固相萃取柱(如Oasis HLB或 MCXCartridges等)，同时操作复杂且成本高、时间长，更为不利的是目标物溶解体系多步转换极易造成目标物损耗甚至丢失严重影响重复性。

鉴于上述国标法的局限性，江苏、浙江等省份制定了莱克多巴胺残留样本确证和精确定量分析的省内参考标准，其基本操作规程是：用简化处理方法使待测样本中目标物充分释放，获取呈游离态目标物上清样本后掺入适量同位素标记莱克多巴胺标准品(如氘标记的莱克多巴胺-Rac-D9) 作内标物，再将该混合物通过反相固相萃取柱(大量基质保留，目标物和内标物流出)净化，净化物直接进样作LC-MS/MS定量测定，利用 LC-MS/MS强大的抗基质干扰能力，通过内标物的回收率作标准回收曲线，以该曲线结合莱克多巴胺机测效应信号强度反推出待测样本中莱克多巴胺残留量。