[发明专利]一种莱克多巴胺特异性免疫亲和层析色谱胶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种莱克多巴胺特异性免疫亲和层析色谱胶，其特征在于，由保藏编号CCTCCNO.C2014127的杂交瘤细胞株分泌产生单抗经纯化再与CNBr-activated Sepharose^TM 4B胶化学交联形成固相化抗体蛋白而获得。

2.根据权利要求1所述的免疫亲和层析色谱胶，其特征在于，所述分泌产生的单抗经间接竞争ELISA测定：IC₅₀为0.35ppb，效价为1：800000，对莱克多巴胺的交叉反应率为100％，与其他β-激动剂的交叉反应率均小于0.005％。

3.根据权利要求1或2所述的免疫亲和层析色谱胶，其特征在于，所述纯化单抗蛋白与CNBr-activated Sepharose^TM 4B胶的用量比：5mg纯化单抗蛋白：1ml CNBr-activatedSepharose^TM 4B溶胀胶。

4.一种根据权利要求1-3所述免疫亲和层析色谱胶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、用保藏编号CCTCC NO.C2014127的杂交瘤细胞株获取单克隆抗体并进行纯化，纯化后的单抗蛋白进行透析预处理，备用；

将CNBr-activated Sepharose^TM 4B进行溶胀、淘洗获得处理胶备用；

步骤2、预处理纯化单抗蛋白中加入步骤1所述处理胶，室温下摆动孵育，然后离心弃上清，加入NaHCO₃/NaCl缓冲溶液，室温下继续摆动孵育离心弃上清，洗涤，获得抗体蛋白交联胶；

步骤3、取步骤2中抗体蛋白交联胶加入Tris-HCl置于室温下摆动孵育以封闭交联胶中未与单抗蛋白交联的活化基团，离心弃上清，然后用HAC-NaAC/NaCl以及Tris-HCl/NaCl两种缓冲液交替离心洗涤，再将交联胶重悬于Tris-HCl/NaCl缓冲液并补加NaN₃，于0℃保存备用，即获得所述免疫亲和层析色谱胶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯化单抗蛋白的透析预处理为：纯化单抗蛋白置于透析袋中，于NaHCO₃/NaCl缓冲溶液中4℃透析过夜，透析后单抗蛋白微孔滤膜过滤，滤液于4℃保存备用。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述将CNBr-activated Sepharose^TM4B进行溶胀、淘洗预处理为：称取CNBr-activated Sepharose^TM 4B冻干粉加入稀HCl溶胀，离心弃上清，加入稀HCl离心洗涤以去除CNBr-activated Sepharose^TM 4B胶中其他小分子化学试剂后，再用NaHCO₃/NaCl缓冲溶液离心洗涤一次，备用。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2为：预处理的纯化单抗蛋白中加入至含步骤1所述处理胶的50ml离心管中，盖好并用parafilm膜封口，置于摆床中室温摆动孵育1h，室温2000r/min 10min弃上清，离心管加30ml 0.1M NaHCO₃/0.5M NaCl缓冲溶液，置于摆床中室温摆动孵育10min，室温2000r/min 10min弃上清，再用上述缓冲溶液重复离心洗涤5-6次以充分去除未交联的蛋白，获得抗体蛋白交联胶。