[发明专利]检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了检测肿瘤标志物 负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法。

背景技术

肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称为癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类 疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对 其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。据WHO研究，2012年全球癌症 患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中 国，中国新增癌症病例高居世界第一位。WHO也指出，及早诊断和治疗是对抗肿瘤疾病的有 效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生 和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、基因等， 是肿瘤早期诊断的重要指标。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，肿瘤标志 物的浓度越高。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，越来越多的高特异性、低丰度肿瘤标志 物被发现，这就对建立快速、高灵敏度、高特异性肿瘤标志物检测技术提出了更高的要求。

免疫分析法是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而建立的高选择性生物化学方 法。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附 分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学免疫分析法(ECIA)、电化学发光免疫 分析法(ECLIA)和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不 足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性， 有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高、选择性差，有的响应时间长、无法重 复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法仍是迫切需求。

电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度高、特 异性好、重现性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析和环 境检测领域。

氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和 丰富的官能团，而基于氧化石墨烯制备的功能化氧化石墨烯稳定性高、制备简单，是构建电 化学发光传感器的理想材料。氮化碳材料(g-C3N4)是一种类似石墨的纳米薄膜，具有比表面 积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身具有极 强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前国内外还没有公开 任何关于基于氧化石墨烯和氮化碳两种纳米复合材料的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学 发光免疫传感器的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异 性强的检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物负载分子筛电 化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

取8μL、1.5～2.5mg/mL的哌嗪修饰的氨基化石墨烯的壳聚糖溶液滴加到电极表面，室 温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；滴加8μL、浓度为0.8～1.0mol/L的1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.3～0.4mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表 面，4℃冰箱中孵化40min，室温下晾干；

步骤(2)、在步骤(1)修饰的工作电极表面滴加8μL、10～12μg/mL的肿瘤标志物一 抗，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

步骤(3)、在步骤(2)修饰的工作电极表面滴加8μL、质量分数为2～4％的BSA溶 液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

步骤(4)、在步骤(3)修饰的工作电极表面滴加8μL、质量分数为3～3.5％的牛血清 白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱 中晾干；滴加8μL、10～100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲 洗电极表面，4℃冰箱中干燥；