[发明专利]检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

取8μL、1.5～2.5mg/mL的哌嗪修饰的氨基化石墨烯的壳聚糖溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；滴加8μL、浓度为0.8～1.0mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.3～0.4mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化40min，室温下晾干；

步骤(2)、在步骤(1)修饰的工作电极表面滴加8μL、10～12μg/mL的肿瘤标志物一抗，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

步骤(3)、在步骤(2)修饰的工作电极表面滴加8μL、质量分数为2～4％的BSA溶液，封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

步骤(4)、在步骤(3)修饰的工作电极表面滴加8μL、质量分数为3～3.5％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加8μL、10～100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

步骤(5)、在步骤(4)修饰的工作电极表面先滴涂8μL、2～4mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干；再滴加8μLSAPO-34-Pd/Co-Ab2二抗孵化物溶液，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器。

2.如权利要求1所述的检测肿瘤标志物负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：

①磺化碳纳米管的制备

称取2.0～2.5g的多壁碳纳米管置于500mL三口烧瓶中，依次加入88mL浓硫酸和45mL浓硝酸，180℃油浴下反应60～70min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加400mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于90～100℃真空干燥箱内干燥15～18h，得到磺化碳纳米管；

②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备

在250mL圆底烧瓶中依次加入12～16mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应2.5～3.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；

所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；

③银纳米粒子溶液的制备

将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入50～55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；

④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备

取10～15mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到35～45mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡12～15h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；

将4～8mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入200μL、100～110μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。