[发明专利]抗寒月季组织培养繁育方法

权利要求书

1.一种抗寒月季组织培养繁育方法，其特征是：包括以下步骤：

1）外植体筛选：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用枝剪将带新芽的枝条剪下，作为外植体；

2）外植体消毒：带嫩芽的枝条切成小段，每段带有1-3个芽，置于200mL烧杯中，杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度1‰氯化汞溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20制成消毒液，轻轻摇晃，6-8分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；

3）初代培养：将消毒好的外植体材料用已消毒滤纸吸干，切去外植体材料木质化部分及嫩芽展出叶片，插于基本培养基MS上，培养约30天，培养室内温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为1800-2000勒克斯；

4）增殖培养：将初代培养的外植体材料，转接于第一培养基上，所述第一培养基构成为：基本培养基MS附加0.01mg/L萘乙酸和1mg/L 6-苄氨基嘌呤；蔗糖25g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；

培养室内适宜温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为2000勒克斯，培养5-6周，有少量不定芽萌发，切下不定芽接种于第二培养基上，所述第二培养基构成为：基本培养基MS附加0.05mg/L萘乙酸和2mg/L6-苄氨基嘌呤；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内温度为22-24℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为2000勒克斯；培养4-5周，外植体材料分化不定芽数量增多，每个外植体萌发出6-8个小侧芽；若需大量繁殖种苗，进行重复培养；

5）壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基MS中，培养3-4周，丛生芽长成无菌苗，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中较大的无菌苗直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯；

6）生根培养：将无菌苗转接至生根培养基；所述生根培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，其中减半大量元素，由质量浓度950mg/L的硝酸钾，220mg/L的氯化钙，185mg/L的硫酸镁，825mg/L的硝酸铵，85mg/L的磷酸二氢钾组成；附加1mg/L萘乙酸；1mg/L吲哚丁酸和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯，培养10天，无菌苗长出乳白色根须，根长度为0.8-1.5cm；

7）移栽驯化：待无菌苗根长大部分为0.8-1.5cm时，将其移至过渡培养间，瓶膜不完全揭开，敞开约1/3，以保持瓶内与过渡间环境一致，放置2天后，去掉瓶膜后再放置1天；采用水温20-22℃的水轻轻洗去无菌苗根部附着的培养基，将其移栽到装有珍珠岩和蛭石体积比为2：1的苗盘中，在半遮阴条件下放置5-7天后，在温室驯化培养，30天后，计算成活率，即完成组织培养繁育。