[发明专利]一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR‑T细胞及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，尤其涉及一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用，其具体为一种嵌合抗原受体CAR转入脐血T细胞构建成嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)以及其细胞制剂的制备方法。

背景技术

利用免疫学治疗手段来攻克肿瘤，一直是免疫学在转化医学方面应用的重要方向。随着各种组学(基因组学，蛋白组学等)的发展，肿瘤细胞由于突变产生的免疫原性得到了广泛的认可，这为肿瘤免疫治疗奠定了理论的基础。同时，随着肿瘤免疫学研究自身的积累，肿瘤免疫治疗近期取得了巨大的进步，一系列新的免疫治疗手段逐步进入临床。当前的肿瘤免疫学研究，奠定了T细胞杀伤在肿瘤免疫治疗中的中心地位，而CAR-T细胞就是结合了抗体的靶向识别和T细胞的肿瘤杀伤功能，人工修饰生成的肿瘤杀伤细胞。

嵌和抗原受体T细胞的概念最早在1989年被Gross，Waks和Eshhar提出，他们将识别TNP的抗体表达在T细胞上，实现了抗原特异性的、非MHC限制的T细胞的活化和效应的增强，并提出了CAR-T技术在肿瘤治疗中的应用的概念。根据这一原理，将具有肿瘤特异性的抗体嵌入T细胞，将赋予T细胞新的杀瘤能力。之后，CAR-T技术被引入到抗肿瘤临床试验中，但早期的CAR-T细胞由于其胞内信号传递域仅含有第一信号，而且选择的肿瘤类型为实体瘤，最终的临床结果都不太理想。在2008年，Fred Hutchison肿瘤研究所等机构使用CAR-T对B细胞淋巴瘤来进行治疗，虽然治疗结果不太理想，但这一临床实验的关键在于证实了以表达CD20的B细胞作为靶点的CAR-T治疗是相对安全的。随后，在2010年NCI报道了一例B细胞淋巴瘤治疗成功的病例，利用针对CD19的CAR-T，病人的淋巴瘤得到控制，正常B细胞也被清除，血清Ig显著降低，为CAR-T治疗B细胞来源的淋巴瘤的有效性提供了理论和实际的支持。在2011年，美国宾夕法尼亚大学的的Carl June博士领导的团队将特异性识别CD19的CAR-T用于B细胞来源的慢性淋巴细胞白血病的治疗，显示了“治愈”的疗效，随后在复发难治性急性淋巴细胞白血病展开临床实验，也取得了良好的疗效。由于这一突破性的进展以及其他免疫调控手段的发展，Science杂志将肿瘤免疫治疗评为了2013年科技突破进展的第一名。这一成功在世界各国引起了广泛的影响，各国开始大量开展基于CAR-T的科学研究和肿瘤治疗的临床试验。

CAR的结构由胞外抗原识别结构域，胞外铰链区，跨膜区和胞内的信号传导结构域组成。胞外的抗原识别域通常是由单链抗体组成(如anti-CD19，CD20，EGFR，HER2，EGFRVIII等)，特异性识别肿瘤细胞膜表面分子，也可以是某些肿瘤特异抗原的配体或受体(如NKG2D等)等。胞外铰链区是一段用于隔开抗原识别域和跨膜区的空间结构，其目的是为了提供合适的空间位置，使得胞外抗原识别域能够在识别抗原前后维持正确的结构并传导胞内信号，通常选择CD8a或IgG的一段作为铰链区。跨膜区是为了保证CAR分子在膜表面定位的结构域，通常选择CD8a，CD28，CD137或CD3等分子的跨膜区。胞内信号传导结构域是介导CAR信号传导的关键部分，通常是一个或几个第一信号(如CD3zeta)，第二信号(共刺激信号如CD28，CD137，ICOS，OX40等)的组合。第一代CAR只含有第一信号CD3zeta，第二代CAR有一个第一信号CD3zeta和一个第二信号，第三代CAR有一个第一信号CD3zeta和两个第二信号结构域。除了第三代CAR-T，目前还有其他新的CAR-T设计策略，即在第二代CAR-T的基础上引入了新的独立于CAR的调节分子，如细胞因子IL-12，其他共刺激因子41BBL等，以进一步增强CAR-T的功能。

HIV病毒主要感染人的CD4+T细胞，导致T细胞数量急剧下降，进而导致病人免疫力的下降，也就是艾滋病。艾滋病人群体中，部分肿瘤的发病率高于非艾滋病人，尤其是非霍奇金淋巴瘤(NHL)、卡波西肉瘤和宫颈癌。和非艾滋病人相比，艾滋病人的非霍奇金淋巴瘤发病率更高，死亡率也高，且在病征上表现更为恶性，通常在诊断发现肿瘤时，已经处于肿瘤病症重期，这也可能是其死亡率高的原因之一。最常见的艾滋相关的淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，主要是原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)和伯基特淋巴瘤(BL)，而原发性渗出性淋巴瘤(PEL)，霍奇金淋巴瘤(HL)，浆母细胞淋巴瘤发病率低一些。其他类型如T细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤较少见。在非霍奇金淋巴瘤中，最主要的是弥漫性大B细胞淋巴瘤，艾滋病人发病率比非艾滋病人高60多倍。