[发明专利]一种适于抗体纯化的亲和层析介质及应用

说明书

本发明公开了一种适于抗体纯化的亲和层析介质及应用。本发明提供的亲和层析介质包含固相载体以及与固相载体偶联的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组蛋白A。本发明提供的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，非常适合于抗体的分离纯化。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种亲和层析介质及应用。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus protein A，SPA，蛋白A)为金黄色葡萄球菌细胞壁相关蛋白，为单链多肽结构，具有与人类和其它哺乳动物血液中免疫球蛋白分子的Fc段特异性结合的能力，主要吸附IgG和含IgG的免疫复合物。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年，Jensen也发现了类似的现象，将其命名为A抗原。1960年Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA蛋白A，1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质。由于SPA具有吸附蛋白的特性，蛋白A制备的亲和层析柱已成为生物技术领域广泛应用的纯化抗体的亲和柱，通常在制备蛋白A亲和层析介质时，所用到的环氧氯丙烷活化琼脂糖都以水为反应介质，环氧氯丙烷在水中的溶解度约为6.58％左右，因此该反应是一个复杂的油(环氧氯丙烷)-水-固(凝胶)三相反应体系，反应速率较慢；同时环氧化过程中环氧基在碱性条件下极易发生水解副反应，需要对反应条件进行全面优化和严格控制才能获得较高的活化效率。史清洪等通过在反应介质中引入DMSO有效消除了环氧氯丙烷对琼脂糖活化过程中的相界面，使环氧基密度有效提高到了100μmol/mL左右，但反应介质为水，水解反应仍较严重【史清洪等。环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶过程强化及性能评价[J].过程工程学报,2007,7(4):743-746.】。

目前，随着生物技术产业，尤其是生物制药产业的快速发展，众多抗体药物获准上市，例如，Imclone公司开发的一种鼠/人嵌合的单克隆抗EGFR抗体(爱必妥、cetuximab、西妥昔单抗)，其通过竞争性拮抗配体与EGFR的结合，封锁受体与配体的结合继而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活，从而使肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞中多种由EGFR信号通路调节的细胞过程被阻断，从而达到治疗肿瘤的目的，目前已被用于治疗结直肠癌、头颈部肿瘤等恶性疾病。

随着大量抗体药物的上市，蛋白质纯化技术越来越受到大家重视，蛋白A亲和柱的市场需求迅速增加，且对蛋白A亲和柱的亲和力、纯化效率等要求越来越高。但在使用含有蛋白A的亲和层析技术时，存在亲和力低、纯化效率低等问题，因此在施用该亲和层析技术时，需要一种改进的亲和层析介质，提高纯化效果。

发明内容

本发明人经过大量研究，通过基因技术手段，开发了一种新型亲和层析介质。具体的，本发明提供了：

1、一种重组蛋白A，其特征在于，所述重组蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、一种亲和层析介质，其特征在于，所述亲和层析介质包含权利要求1所述的重组蛋白A和固相载体，所述固相载体与重组蛋白A偶联。

3、上述2所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。

4、上述3所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体是琼脂糖或葡聚糖凝胶。

5、一种制备上述1-4任一所述的亲和层析介质的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)通过化学合成的方法设计合成重组蛋白A基因单体，5‘端Ala-Asp突变成Asn-Val，以形成AclI酶切位点，各重组蛋白A基因单体间以AclI酶切位点相连，第一个重组蛋白A基因单体前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His和EK酶切位点，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入中止密码子TAA和与表达载体pET32a相连的BamH I酶切位点；