[发明专利]马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定方法。

背景技术

马铃薯疮痂病是一种世界性病害，随着马铃薯种植面积的扩大，其危害程度不断加重，严重影响马铃薯种薯的生产和商品薯的外观和销售价格，已成为马铃薯生产上四大主要病害之一。

疮痂病菌主要在马铃薯块茎和匍匐茎上侵染形成病斑，不侵染地上部分。马铃薯块茎在疮痂病原菌侵染后，在块茎组织的病健交接处块茎组织颜色呈现枯黄或半透明症状，在发病初期，在块茎表皮上产生褐色或深褐色小斑点，当条件适宜时病斑呈不规则形状扩大，并产生大量木栓化细胞，使病斑处表皮变粗糙；到后期，块茎表面会形成或深或浅凹凸不平的痂状病斑，发病严重的薯块会造成较大的病斑，严重影响马铃薯的品质。

马铃薯块茎发病的严重程度以及病斑的大小和深度因品种的抗性、致病菌种类、环境条件等的不同而不同。研究马铃薯疮痂病的致病病原菌，分析致病菌的多样性及致病机制，可为马铃薯疮痂病的防治提供理论基础。

现有的马铃薯疮痂病菌的分离纯化方法采用的是组织分离法，需要连续纯化三次后获得纯链霉菌菌株。对纯化后的链霉菌进行分子鉴定，还需要收集菌体后提取病原菌的总DNA，然后进行PCR扩增，将扩增产物进行测序后进行序列比对。目前的分离纯化方法需要约15天的时间，还会增加实验操作过程中的污染问题；另外，在获得单菌落后进行分子鉴定过程中需要提取菌株的DNA，提取的过程也比较复杂费时，因此整个分离纯化与分子鉴定的过程比较漫长，导致病原菌鉴定过程缓慢，影响下一步的试验进度。

因此，开发一种成本低，耗时短，操作简单的马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法及分子鉴定的方法尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，本发明的第二个目的在于提供一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，以缓解现有技术中存在的耗时长、成本高、操作复杂易导致污染的技术问题。

本发明提供的一种马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括：

取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织，经预处理后得预处理混合物，将所述预处理混合物利用玻璃珠涂布于培养平板上，经培养后得到马铃薯疮痂病病原菌单菌落，完成所述马铃薯疮痂病病原菌的分离纯化。

进一步地，所述病斑组织为去除所述马铃薯疮痂病病斑表层后的组织。

进一步地，所述预处理的方法为：将所述病斑组织消毒后研磨并离心。

进一步地，所述预处理混合物为上清液。

进一步地，在取马铃薯疮痂病病薯的病斑组织前，还包括所述马铃薯疮痂病病薯的前处理。

进一步地，所述前处理的方法为：将所述马铃薯疮痂病病薯用清水洗净后，再用医用酒精消毒，并用ddH₂O冲洗，之后将所述马铃薯疮痂病病薯进行干燥处理。

另外，本发明还提供了一种马铃薯疮痂病病原菌的分子鉴定方法，所述分子鉴定方法包括：

取应用上述的分离纯化方法得到的马铃薯疮痂病病原菌单菌落，于液体培养基中培养为菌液后，取所述菌液进行PCR反应，并利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，将所述扩增结果条带与目的条带相符的扩增产物进行测序，得到测序结果；将所述测序结果在数据库中进行序列比对，鉴定所述单菌落是否为马铃薯疮痂病病原菌。

进一步地，所述PCR反应为进行16S rDNA序列扩增；所述扩增的引物为：

Primer F:5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′(SEQ ID NO.1)

Primer R:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′(SEQ ID NO.2)。

进一步地，在所述测序之前，还包括将所述与目的条带相符的扩增条带回收目的基因片段并连接至克隆载体上，得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，涂布抗性平板，进行鉴定；对鉴定为阳性的菌落进行测序，得到测序结果。

进一步地，所述马铃薯疮痂病病原菌为链霉菌。