[发明专利]异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法

说明书

本发明公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。所述产羟基酪醇的宿主中导入了羟基酪醇生产的代谢途径。更确切的说，是在宿主中高效表达了氨基转移酶(Aminotransferase)，酮酸脱羧酶(Ketoacid decarboxylase)，醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)来生产酪醇，再引入4‑羟基苯乙酸羟化酶(4‑Hydroxyphenylacetate hydroxylase)来生产羟基酪醇。这些酶所编码的基因构建在表达质粒上或者整合到基因组上。将酶所编码的基因导入宿主中，结果得到了可以利用葡萄糖，甘油，酪氨酸等生产羟基酪醇的生产宿主，同时本发明还公开了一种双相培养的方法，使得羟基酪醇的生产更为高效。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成酪醇，羟基酪醇的代谢途径及双相培养的方法，通过增强上游莽草酸途径酶的表达，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的外源酶，选用原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞作为宿主细胞，最终提高了酪醇，羟基酪醇的产量。

背景技术

酪醇是红景天属植物中主要活性化合物之一，具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗癌、延缓衰老、调节机体免疫等方面具有显著作用，其主要用作医药、香料合成的中间体，例如合成心血管药美多心安，倍它素洛尔等。羟基酪醇(HT)是主要在橄榄中存在的天然酚类化合物，它具有强大的抗氧化活性，许多研究已经证明了羟基酪醇的疾病预防潜力，它可以保护脂质免受氧化损伤，抑制血小板聚集，具有清除自由基的作用，还有着抗肿瘤、抗炎、抗微生物等活性。此外，羟基酪醇具有良好的生物利用度和没有已知的毒性。因此，它在食品添加剂，功能食品甚至药品中的有着巨大的应用前景。然而，由于缺乏有效的生产方法，羟基酪醇还无法进行大规模生产。目前，羟基酪醇主要来源于橄榄叶提取物，或从橄榄油或橄榄油厂废水萃取，但是这些过程回收率低，持续时间长，环境污染大，产品纯度低，且难以分离。而其他报道用化学转化或生物转化来合成羟基酪醇的方法，也都存在产量低，路径复杂，周期漫长等缺点。本发明主要目的在于实现羟基酪醇的生物学方法的高效合成。筛选了催化效率较高的酶来实现羟基酪醇的生产，同样人工设计了新的代谢途径实现了羟基酪醇的从头合成，另外本发明还公开了一种双相培养的发酵方法来提高羟基酪醇的产量。实验结果表明，在优化条件下，酪醇从酪氨酸或从简单的碳源利用代谢工程菌能分别达到1469±56mg/L和550±26mg/L的产量，羟基酪醇从酪氨酸或从简单的碳源利用代谢工程菌能分别达到1243±165mg/L和647±35mg/L的最终产量。

发明内容

本发明的目的是提供了高产酪醇的宿主，通过向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入中一条高效生产酪醇的途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)、酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，通过这些酶在宿主中的高效表达，实现酪醇从葡萄糖，甘油，酪氨酸的合成。

本发明的目的是提供了高产羟基酪醇的宿主，通过向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入一条高效生产羟基酪醇的途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)，通过这些酶在宿主中的高效表达，实现羟基酪醇从葡萄糖，甘油，酪氨酸的合成。

本发明的又一目的是提供一种双相培养的方法，通过在发酵开始后的0h-36h中采取1-4次等量添加有机溶剂正辛醇，正壬醇，正癸醇，正己烷或乙酸已酯的方法来实现酪醇与羟基酪醇的高效萃取，以减少生物毒性来实现酪醇与羟基酪醇的高效生产。

本发明的另一个目的是提供所述产酪醇、羟基酪醇的不同宿主的发酵生产方法。

为了实现上述目的，本发明提供了能够产酪醇，羟基酪醇的宿主，向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入含有这两种化合物生物合成路径相关基因，制备所述的酪醇，羟基酪醇的不同宿主。