[发明专利]用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的多重检测的核酸、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一组用于同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体三种病原菌的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原菌的核酸包括分别用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的核酸还包括有各病原菌对应的探针。本发明还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生。

技术领域

本发明属于生物检测技术，具体涉及一种用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体多重检测的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

苦楝(Melia azedarach)是我国重要的乡土树种之一，该树种在湿润的沃土上生长迅速，对土壤要求不严，在酸性土、中性土与石灰岩地区均能生长，是平原及低海拔丘陵区的良好造林树种，该树种也是良好的园林绿化树种的用材树种，此外也是高效、低毒的广谱植物源农药之一，苦楝产业在我国逐渐兴起。近年来，苦楝的溃疡病、褐斑病和丛枝病发病率逐渐上升，而且三者复合侵染的情况越来越多，给种植苦楝的用户造成极大损失。目前尚缺乏苦楝的溃疡病、褐斑病和丛枝病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这三种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这三种病害的侵入，因此，针对苦楝的溃疡病原、褐斑病和丛枝病，建立早期快速定量检测方法就显得尤为重要。

苦楝溃疡病主要为害叶片和枝梢。叶片染病，初在叶背产生黄色或暗黄绿色油渍状小斑点，后叶面隆起，呈米黄色海绵状物。后隆起部破碎呈木栓状或病部凹陷，形成褶皱。后期病斑淡褐色，中央灰白色，并在病健部交界处形成一圈褐色釉光，凹陷部常破裂呈放射状。枝梢染病，初生圆形水渍状小点，暗绿色，后扩大灰褐色，木栓化，形成大而深的裂口，最后数个病斑融合形成黄褐色不规则形大斑，边缘明显。

苦楝褐斑病主要危害叶片，病斑先在顶部叶片的尖端发生，最初为浅黄色，逐渐变为黄褐色或深褐色，圆形或椭圆形，小病斑常汇集在一起，严重时在叶片上出现几段甚至全部布满病斑，在叶鞘和叶脉上出现较大的褐色斑点，发病后期病斑表现破裂，叶细胞组织呈坏死状，散出褐色粉末，叶脉和维管束残存如丝状。

苦楝丛枝病主要由类菌原体和真菌所致，枝条受害后，因顶芽生长受到抑制而刺激侧芽提前萌发成的小枝，不仅生长缓慢，且其顶芽不久也受到病原物的抑制，而刺激其侧芽再萌发成小枝。如此反复进行，使枝条呈丛生状。枝上的叶小而带黄绿色，内部栅状组织与海绵组织的分化不明显。病枝初时可开花、结果，但花果往往畸形。渐后则花而不实，最后不开花。枝丛多能存活若干年，终因累生新的枝叶，养分消耗过度而枯死。由于枝条组织较正常者柔嫩，易遭冻害。

目前，溃疡病菌的常规检验法有典型症状目测法、组织病理切片法和病原菌分离培养及致病性测定法。常规的致病性测定法可以测定病菌的存活状态，因而可以正确评价检疫性有害生物传播扩散的危险性。但需要通过病原菌的分离培养、致病性测定来验证。但常规方法检测周期长，容易误判。分离培养对于显症样品可以取一小块病健交界处的病组织，在灭菌蒸馏水中捣碎制成菌悬液。如果看不到症状，可以取混合叶片样品，用蛋白胨磷酸缓冲液浸泡振荡在室温下富集培养6-8小时，然后将菌悬液直接或离心浓缩后在PSA或YSA培养基上划线，28℃分离2-3天后选取全缘、隆起鲜亮的淡黄色圆形小菌落。可见现有的溃疡病菌的检测方法存在有检测时间长等缺陷。

苦楝溃疡病、褐斑病、丛枝病在广东、海南、福建江西、安徽等省的苦楝种植区均由发生，严重林段发病率达50％以上，常造成苦楝大量死亡，已经成为部分地区发展苦楝种植及成片造林的严重阻碍。针对溃疡病原、褐斑病原和丛枝病植原体的检测方法，目前尚无能够快速同时检测这三种病原菌的方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于多重PCR同时检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的核酸、试剂盒及其检测方法。