[发明专利]用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的多重检测的核酸、试剂盒及方法

权利要求书

1.一组用于多重PCR同时检测三种病原菌的核酸，其特征在于，包括用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物，其中，所述溃疡病菌的上游引物序列如SEQID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述褐斑病菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；

所述丛枝病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ IDNo.10所示。

2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的核酸，其特征在于，包括如权利要求1中所述的用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物和各病原菌对应的探针，

所述溃疡病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

所述褐斑病菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；

所述丛枝病植原体的探针序列如SEQ ID No.11所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性扩增产物，其中，

所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2中所述的用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的阳性扩增产物，其中，

所述检测溃疡病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.4中第29-194bp之间所示的序列；

所述检测褐斑病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.8中第20-213bp之间所示的序列；

所述检测丛枝病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第2-134bp之间所示的序列。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix EX TaqTM×2。

7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原菌的检测方法，其特征在于，该方法用于检测溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体这三种病原菌，具体包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述溃疡病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQ1；所述褐斑病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，其探针5'端和3'端分别对应标记JOE和TAMRA；所述丛枝病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。