[发明专利]一种生产L‑酪氨酸重组工程菌的方法及该重组工程菌的应用

说明书

技术领域

本发明所属生物技术领域，特别涉及一种L-酪氨酸重组工程菌的构建及其生产L-酪氨酸和丹参素的方法。

背景技术

L-酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸，对人和动物的新陈代谢、生长发育起着重要的作用。其常作为、苯丙酮尿症患者的营养补充剂，以及多肽类激素、抗生素、L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等的制备原料而广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业。基于此，最近几年L-酪氨酸及其衍生物的合成吸引了越来越多研究者的目光。由于天然微生物合成积累L-酪氨酸的能力很低，即使构建的重组工程菌，仍然需要使用抗生素维持质粒和诱导剂使基因过表达，存在破坏和污染环境的潜在危害性。

丹参素是一种L-酪氨酸的衍生物，其化学名为β-(3,4-二羟基苯基)乳酸。最新的药理研究表明，丹参素能够抑制血小板合成和聚集，提高心肌耐缺氧能力、保护心肌，同时增加冠脉流量。这些药理作用是丹参注射液治疗冠心病、心肌缺血的主要机制。因此丹参素在心脑血管疾病方面具有非常好的功效，如：抗动脉粥样硬化及降血脂，抗血栓形成，扩张冠状动脉，保护心肌线粒体免受氧自由基引发的脂质过氧化物的损伤等作用。此外有研究发现其在抗菌消炎，防止创面的过度愈合，抗脑缺血损伤，素抗肿瘤，治疗银屑病等方面也有较好的作用。因此丹参素拥有广阔的市场和应用前景。目前丹参素主要从丹参根中提取，但含量低，受到种植季节和原材料的限制，生产能力低。微生物合成具有成本低、产量高的优点，本专利就是构建出L-酪氨酸生产重组工程菌及其衍生菌株，实现L-酪氨酸和丹参素的微生物发酵生产。

发明内容

本发明的目的是针对目前L-酪氨酸和丹参素生产现状，提供生产L-酪氨酸和丹参素的重组工程菌。

本发明的第二个目的是提供上述重组工程菌在发酵生产L-酪氨酸和丹参素的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产L-酪氨酸的重组工程菌，用下述方法构建：

(1)以大肠杆菌SyBE-002447基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F1；设计并化学合成模块P_lac-aroG-tyrA-aroE，序列如SEQ ID No.3所示，以该序列为模板，以SEQ ID No.4所示序列为上游引物，以SEQ ID No.5所示序列为下游引物，克隆得到3500bp左右的片段F2；以化学合成序列CHL基因为模板，其序列如SEQ ID NO.6所示，以SEQ ID No.7所示序列为上游引物，以SEQ ID No.8所示序列为下游引物，扩增得到1000bp的F3片段；以大肠杆菌SyBE-002447基因组为模板，以SEQ ID No.9所示序列为上游引物，以SEQ ID No.10所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F4。

(2)把(1)中获得的四个重组片段通过重叠延伸的方法组装成重组片段F1-F2-F3-F4。以大肠杆菌SyBE-002447菌株为底盘细胞，利用λred同源重组的方法整合F1-F2-F3-F4片段到SyBE-002447菌株的染色体上，然后从染色体上丢失氯霉素抗性基因，得到重组菌株SyBE-22001，用于发酵生产L-酪氨酸。

(3)以(2)中得到的菌株SyBE-22001基因组为模板，以SEQ ID No.11所示序列为上游引物，以SEQ ID No.12所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F5；设计并化学合成L-酪氨酸合成模块P_trc-pps-tkt-glk，序列如SEQ ID No.13所示，以该序列为模板，以SEQ ID No.14所示序列为上游引物，以SEQ ID No.15所示序列为下游引物，克隆得到5700bp左右的片段F6；以序列SEQ ID No.6(CHL基因)为模板，以SEQ ID No.16所示序列为上游引物，以SEQ ID No.17所示序列为下游引物，扩增得到1000bp的片段F7。以菌株SyBE-22001基因组为模板，以SEQ ID No.18所示序列为上游引物，以SEQ ID No.19所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F8。