[发明专利]一种生产L‑酪氨酸重组工程菌的方法及该重组工程菌的应用

权利要求书

1.一种生产L-酪氨酸的重组工程菌的方法，其特征在于用下述方法构建：

(1)以大肠杆菌SyBE-002447作为出发菌株，采用λred同源重组和抗性丢失方法，用全化学合成模块P_lac-aroG-tyrA-aroE整合替换染色体上的paa基因簇位置，获得菌株SyBE-22001；

(2)在(1)中得到的菌株SyBE-22001，采用λred同源重组和抗性丢失方法，用全化学合成模块P_trc-pps-tkt-glk整合替换染色体上的lacI基因的位置，获得菌株SyBE-22002；

(3)在(2)中得到的菌株SyBE-22002，采用λred同源重组和抗性丢失方法，用全化学合成模块P_tacs-hpaBC-ldh整合插入到染色体上nupG下游位置，获得菌株SyBE-22011。

2.根据权利要求1所述的生产L-酪氨酸的重组工程菌的方法，其特征在于步骤(1)的具体方法是：

以大肠杆菌SyBE-002447基因组为模板，以SEQ ID No.1所示序列为上游引物，以SEQ ID No.2所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F1；

设计并化学合成模块P_lac-aroG-tyrA-aroE，序列如SEQ ID No.3所示，以该序列为模板，以SEQ ID No.4所示序列为上游引物，以SEQ ID No.5所示序列为下游引物，克隆得到3500bp左右的片段F2；

以化学合成序列CHL基因为模板，其序列如SEQ ID NO.6所示，以SEQ ID No.7所示序列为上游引物，以SEQ ID No.8所示序列为下游引物，扩增得到1000bp的F3片段；

以大肠杆菌SyBE-002447基因组为模板，以SEQ ID No.9所示序列为上游引物，以SEQ ID No.10所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F4；把中获得的四个重组片段通过重叠延伸的方法组装成重组片段F1-F2-F3-F4，以大肠杆菌SyBE-002447菌株为底盘细胞，利用λred同源重组的方法整合F1-F2-F3-F4片段到SyBE-002447菌株的染色体上，然后从染色体上丢失氯霉素抗性基因，得到重组菌株SyBE-22001。

3.根据权利要求1所述的生产L-酪氨酸的重组工程菌的方法，其特征在于步骤(2)的具体方法是：

以步骤(1)中得到的菌株SyBE-22001基因组为模板，以SEQ ID No.11所示序列为上游引物，以SEQ ID No.12所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F5；

设计并化学合成L-酪氨酸合成模块P_trc-pps-tkt-glk，序列如SEQ ID No.13所示，以该序列为模板，以SEQ ID No.14所示序列为上游引物，以SEQ ID No.15所示序列为下游引物，克隆得到5700bp左右的片段F6；

以序列SEQ ID No.6(CHL基因)为模板，以SEQ ID No.16所示序列为上游引物，以SEQ ID No.17所示序列为下游引物，扩增得到1000bp的片段F7；以菌株SyBE-22001基因组为模板，以SEQ ID No.18所示序列为上游引物，以SEQ ID No.19所示序列为下游引物，克隆得到500bp的片段F8；

把获得的四个重组片段通过重叠延伸的方法组装构建重组片段F5-F6-F7-F8，利用λred同源重组的方法整合片段F5-F6-F7-F8到SyBE-22001菌株的染色体上，然后从染色体上丢失氯霉素抗性基因，得到重组菌株SyBE-22002。