[发明专利]血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法。

背景技术

血栓病是一种死亡率颇高的病症，其形成病症包括所有影响血流的病理状态的病症，与血管阻塞导致的减少血流相关或与增加的出血倾向相关。动脉血栓形成，见于冠状动脉硬化性心脏病，当冠状动脉分支或主干形成血栓引起心肌缺血时，可出现心绞痛或心肌梗死；脑动脉血栓形成可导致过性脑缺血发作、脑梗死引起偏瘫、意识障碍或视网膜中心动脉闭塞引起双目失明周围动脉闭塞可引起肢体缺血性坏死等症状。静脉血栓形成见于血栓性静脉炎或深静脉血栓形成和肺栓塞；微循环血栓形成，见于溶血性尿毒症、爆发性紫癜和弥散性血管内凝血等症状。

目前，患者或主治医生通常不能意识到上述病症发病前的潜在因素，直到所述因素爆发最终导致上述病症的出现，难以挽救。为此，极为需要能够用于识别血管变性的诊断方法和手段，使得人们能够尽可能早地做出诊断和相应地进行治疗性干预。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法，适用于快速、准确、客观定性检测人类基因组DNA中与血栓生成易感因素相关的基因多态性位点：rs6025、rs1613662、rs1799963、rs6048、rs12343867、rs1801133和rs4244285。

本发明通过如下技术方案予以实现：

一种血栓病易感基因联合检测试剂盒，包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ由3管660μl/管PCR扩增试剂混合物、1管410μl/管PCR扩增引物混合物、1瓶4.2ml/瓶杂交缓冲液、1管125μl/管阴性参考品和1管125μl/管阳性参考品组成，所述PCR扩增试剂混合物由Hot Start Taq酶、UNG酶、dUTP、dNTP、缓冲系统组成，所述PCR扩增引物混合物由引物组成，所述杂交缓冲液由Tris-Hcl、TritonX-100、NaCl、甲酰胺、blocking组成，所述阴性参考品由纯化水组成，所述阳性参考品由质粒组成；所述试剂盒Ⅱ由2瓶45ml/瓶20×SSC、1瓶40ml/瓶10％SDS和1盒50测试/盒基因芯片组成。

所述试剂盒Ⅰ：-18℃以下避光保存，有效期6个月；包装打开后，4℃储存，有效期1个月；所述试剂盒Ⅱ：室温10-30℃下、避光保存，有效期6个月。

本发明血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，包括如下步骤：

(1)样本采集：采集口腔上皮细胞标本，先用清水漱口，将棉拭子伸入口腔中，在口腔内侧脸颊粘膜处左右各刮拭10次，在刮拭的同时棉签要转动，将取样后的棉拭子放入无菌采样管中密封送检；

(2)芯片洗脱液配制：在芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10％SDS＝100：5：1配制洗脱液Ⅰ，按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10％SDS＝400：1：4配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；

(3)样本处理：向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子，将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入100μl核酸提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液即为临床样本DNA；取5μl参考品，加入50μl DNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为参考品DNA；

(4)PCR扩增及标记：取临床样本DNA或参考品DNA 5μl、PCR扩增试剂混合物12.5μl、PCR扩增引物混合物7.5μl于0.2ml PCR薄壁管中进行扩增及标记；

(5)杂交：将恒温台或杂交箱开启升温恒定到42℃，用杂交模块将芯片固定好，预热10min，将PCR产物加热至95℃变性5min，PCR产物变性完毕取出后，立即冰浴3min，取75μl经42℃预热的杂交缓冲液和25μl临床样本扩增-标记产物充分混匀，将混合物全部滴加在芯片矩阵位置，将杂交模块水平放置42℃恒温箱或恒温台上杂交60min；

(6)洗脱：将芯片放入洗脱容器中，在37℃恒温水浴摇床100rpm震荡条件下进行洗脱；洗脱流程：洗脱液Ⅰ，1min；洗脱液Ⅱ，1min，洗脱完毕后，将芯片自然晾干或用低速离心机甩干即可进行扫描；