[发明专利]血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法

权利要求书

1.一种血栓病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，所述试剂盒Ⅰ由3管660μl/管PCR扩增试剂混合物、1管410μl/管PCR扩增引物混合物、1瓶4.2ml/瓶杂交缓冲液、1管125μl/管阴性参考品和1管125μl/管阳性参考品组成，所述PCR扩增试剂混合物由Hot Start Taq酶、UNG酶、dUTP、dNTP和缓冲系统组成，所述PCR扩增引物混合物由引物组成，所述杂交缓冲液由Tris-Hcl、TritonX-100、NaCl、甲酰胺和blocking组成，所述阴性参考品由纯化水组成，所述阳性参考品由质粒组成；所述试剂盒Ⅱ由2瓶45ml/瓶20×SSC、1瓶40ml/瓶10%SDS和1盒50测试/盒基因芯片组成。

2.根据权利要求1所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒Ⅰ技术要求为：-18℃以下避光保存，有效期6个月；包装打开后，4℃储存，有效期1个月；所述试剂盒Ⅱ技术要求为：室温10-30℃下、避光保存，有效期6个月。

3.权利要求1所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样本采集：采集口腔内上皮细胞标本，先用清水漱口，将棉拭子伸入口腔中，在口腔内侧脸颊粘膜处左右各刮拭10次，在刮拭的同时棉签要转动，将取样后的棉拭子放入无菌采样管中密封送检；

（2）芯片洗脱液配制：在芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10%SDS=100：5：1配制洗脱液Ⅰ，按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10%SDS=400：1：4配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；

（3）样本处理：向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子，将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入100μl 核酸提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液即为临床样本DNA；取5μl参考品，加入50μl DNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为参考品DNA；

（4）PCR扩增及标记：取临床样本DNA或参考品DNA 5μl、PCR扩增试剂混合物12.5μl、PCR扩增引物混合物7.5μl于0.2ml PCR薄壁管中进行扩增及标记；

（5）杂交：将恒温台或杂交箱开启升温恒定到42℃，用杂交模块将芯片固定好，预热10min，将PCR产物加热至95℃变性5min，PCR产物变性完毕取出后，立即冰浴3min，取75μl经42℃预热的杂交缓冲液和25μl临床样本扩增-标记产物充分混匀，将混合物全部滴加在芯片矩阵位置，将杂交模块水平放置42℃恒温箱或恒温台上杂交60min；

（6）洗脱：将芯片放入洗脱容器中，在37℃恒温水浴摇床100rpm震荡条件下进行洗脱；洗脱流程：洗脱液Ⅰ，1min；洗脱液Ⅱ，1min，洗脱完毕后，将芯片自然晾干或用低速离心机甩干即可进行扫描；

（7）扫描及结果判定：将干燥后的芯片置于激光扫描仪中使用532nm波长激光扫描，获得扫描数据及图谱，对检测数据进行分析，生成检测报告，HC为杂交对照点探针，NC为阴性参考点探针，IC为提取对照点探针，W表示该基因的正常基因型检测探针，M代表该基因的突变基因型检测探针，先判断对照NC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则继续判断对照HC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则继续进行判断对照IC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则判读结果为“成功”，否则判读结果为“失败”；W /M探针荧光值≥2.0，判读为野生型，0.5＜W /M探针荧光值＜1.5，判读为杂合型，W /M探针探针荧光值≤0.5，判读为突变型。

4.根据权利要求3所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，其特征在于，所述步骤（1）采集的待测样本采用冰壶或泡沫箱加冰袋密封运输，在2-8℃保存不应超过24小时，-18℃以下保存不超过三个月，-70℃以下长期保存。

5.根据权利要求3所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，其特征在于，所述步骤（2）中若10%SDS出现白色絮状沉淀，于42℃条件加热至溶液透明后再使用，洗脱液一次配制可连续使用15天，每个试剂盒中提供的洗脱液在一个月内用完。