[发明专利]一种基于DNA特异片段的熊本牡蛎（Crassostreasikamea）鉴定方法

说明书

技术领域

本专利属于水生动物种质鉴定领域，涉及到一种基于DNA特异性片段的熊本牡蛎物种鉴别的、全新的分子生物学方法，能从广泛分布的牡蛎中，高效、特异性地鉴别出熊本牡蛎。

背景技术

中国沿海牡蛎资源丰富，种类繁多选择合适的的造礁牡蛎是生态学中的重要命题。牡蛎(Ostreidae)为世界性广分布种类，俗称蚝，别名蛎黄、蚝白、海蛎子。它肉味鲜美，质地柔软细嫩，营养丰富，欧洲人称牡蛎是“海洋的玛娜”，“海洋的牛奶”，古罗马人把它誉为“海上美味圣鱼”。日本人则称其为“根之源”、“海洋之超米”。牡蛎是世界上第一大养殖贝类，共有100多种，在我国沿海常见的有5种，即:熊本牡蛎(Crassostreasikamea)、近江牡蛎(C.ariakensis)、长牡蛎(C.gigas)、香港巨牡蛎(C.hongkongensis)、葡萄牙牡蛎(C.angulata)。牡蛎礁(oyster reef)是由大量牡蛎聚集生长于硬底物表面所形成的一种生物礁系统，它广泛分布于温带河口和滨海区。除为人类提供大量鲜活牡蛎以供食用外，牡蛎礁还具有十分重要的生态功能与环境服务价值。牡蛎是牡蛎礁生态系统的“基石物种(keystone species)”。据报道，在中国沿海分布的所有牡蛎中，有造礁能力的物种有近江牡蛎、长牡蛎、和熊本牡蛎；而葡萄牙牡蛎和香港牡蛎目前尚未报道。

准确鉴别牡蛎种类(包括成体和幼体)，对于深入分析牡蛎的空间生态位及造礁能力，检验牡蛎对附着底物空间的竞争利用及定殖能力，阐明牡蛎礁生境复杂性与生态功能之间的相关性，都是至关重要的，可以为牡蛎礁恢复工程中目标物种的筛选提供科学指导。

牡蛎种类从形态上不易区分。牡蛎礁恢复已成为养护近岸渔业资源、修复近岸渔业水域生态系统的重要手段之一。牡蛎(Ostreidae)为世界性广分布种类,由于牡蛎是营固着生活的软体动物，其外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，大多数种类单纯依靠贝壳的外部形态是很难区分的。

牡蛎幼体难以鉴定。牡蛎幼体由于相似度大，鉴别更是困难重重；而传统的形态学分类指标，大多是经验性、专家依赖型的，对于普通人员，特别是基层工作者，使用起来不够方便和实用。因此，在日常的管理和研究中，迫切需要简明、快速、稳定的鉴别方法。DNA是遗传信息的载体，非常稳定，不易受环境的影响，是常用的种质鉴别标记。

中国专利CN 105734133A公开了一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法。包括：提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；利用上游引物和下游引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’-GTTCCGTTCCATCCTTAT-3’，下游引物为5’-AGACCACTTATCCCTCCA-3’；将PCR产物直接进行凝胶电泳，根据得到的PCR产物条带并结合测序的结果，来判断物种类别。该发明申请用到的DNA的目的片段为1506±2bp，不能够快速、简便的区分出熊本牡蛎和其他4种牡蛎，最后还要进行结合测序来判断结果。

发明内容

为了解决牡蛎成体和幼体鉴别中，传统的形态学指标难以鉴定的问题，本发明基于牡蛎基因组，开发出DNA特异片段，利用PCR方法扩增出该特异片段，是一种操作简便、成本低、耗时短、准确率高的熊本牡蛎的分子鉴别方法。

本发明提供的基于DNA特异片段的熊本牡蛎鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取牡蛎基因组DNA；

(2)用引物对步骤(1)中的牡蛎基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为Cs-F2：

5`-CGAAGAGGGGCATGATAAATGAGG-3`，下游引物为Cs-R2：

5`-ATATGAACTTCTCCAACCTCCCC-3`；

(3)将步骤(2)中的PCR产物进行凝胶电泳，在100bp出现信号带的即为熊本牡蛎，其他牡蛎没有信号条带。

其中，步骤(1)中提取牡蛎基因组DNA的方法为用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取。

其中，步骤(2)中PCR产物条带中熊本牡蛎的目的片段为114bp。

其中，步骤(2)中PCR扩增的条件为先95℃预变性3min,然后是35个循环，每个循环包括95℃变性15sec，55℃复性15sec，72℃延伸15sec，最后是72℃延伸3min。

其中，步骤(3)中凝胶电泳的条件为3％的琼脂糖凝胶。

其中，步骤(3)中凝胶电泳的条件为：电压200V，时间28min，缓冲液为TBE。