[发明专利]双羰基还原酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及双羰基还原酶突变体及其应用。具体而言，本发明利用定点饱和突变获得了催化活性等性质得到改进的双羰基还原酶突变体，并利用所述突变体制备3R，5S‑双羟基化合物，所获得的3R，5S‑二羟基化合物的ee值大于99％，de值为90％左右。本发明的双羰基还原酶突变体为关键的药物中间体，尤其是他汀类药物的手性二羟基己酸链的合成提供了高效的催化剂，使3R，5S‑二羟基化合物的工业生产成本得到大幅度降低。

本申请是申请号为201410196920.5，申请日为2014年5月9日，发明名称为“双羰基还原酶突变体及其应用”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及双羰基还原酶突变体及其应用，具体而言，本发明涉及利用定点饱和突变获得的催化活性等性质得到改进的双羰基还原酶突变体即利用所述双羰基还原酶突变体制备3R，5S-双羟基化合物的应用。

背景技术

羰基还原酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，羰基还原酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。而双羰基还原酶能够立体选择性地将二酮酸酯的两个羰基同时还原为相应羟基，可以用于合成关键的药物中间体，尤其是合成他汀类药物的手性二羟基己酸链，如世界上畅销的降胆固醇药物阿托伐他汀(Atorvastatin，立普妥)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)。

目前已知的双羰基还原酶可以作为生物催化剂，一步还原二酮底物，制备得到近乎单一光学纯度的他汀类降血脂药物关键手性中间体3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如酶催化活性较低，使酶液的用量较大，且使反应体系总体积增加，导致了生产批次和生产成本的增加。这些问题可以通过酶分子进化，提高双羰基还原酶(DKR)的自身催化活性来解决。酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。

理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directedMutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。

定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。

因此，如果能够利用定点饱和突变技术改造双羰基还原酶，提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性，就可以解决现有技术中如酶液用量较大、生产成本高等问题。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于利用定点饱和突变技术改造双羰基还原酶，提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性。

本发明的第一方面涉及一种双羰基还原酶突变体，其含有选自如下所示的氨基酸序列之一：

a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；

b)与a)中所示序列具有至少70％同一性且具有改进的双羰基还原酶活性的序列；或