[发明专利]一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术，具体涉及在淡水鱼类中进行微卫星序列的分离及筛选方法。

背景技术

微卫星是常用的可变数目串联重复序列标记(VNTR)之一，又称为简单串联重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）或简单序列长度多态（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）或短串联重复（Short Tandem Repeats，STR），它是DNA分子中的一个片段，以1-6个碱基组成的基序，如（CA）n/（GT）n、（CAC）n/（GTG）n等，成首尾相连串联重复地分布在整个基因组中，一般长几十至几百个bp，其可变重复数构成了微卫星多态性的基础。通常多态性片段的长度在100-300bp。每个特定微卫星基因座均由两部分组成：中间的核心区和两侧的侧翼区。核心区含有短串联的多拷贝序列，重复单位数目是随机改变的，而侧翼序列在进化上相对保守。

微卫星技术是建立在PCR基础上的常用DNA多态性分析方法，微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础，经过精确设计的特异性引物，PCR扩增的条带互不重叠，微卫星扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染方法染色，条带清晰，多态性信息准确；微卫星技术重复性强，且在同一胶片上的序列梯度能提供分辨率达1 bp的微小差异，使微卫星结果精确度高，易于进行比较，充分显示微卫星技术的优越性。因此微卫星技术在鱼类种质资源的研究中也具有重要的应用前景。

1 微卫星标记在性状分析方面的应用

大多数经济性状属数量性状，数量性状在连锁图上的定位分析(QTL，Quantitative Traits Loci) 是农业生物遗传研究的重要方面，是分子育种学科的基础研究。QTL定位是利用图谱和标记对性状进行遗传分析，性状的连锁分析与遗传图谱制备是遗传发展过程中密不可分的同一问题的2个方面。

2微卫星标记在鱼类种质鉴定方面的应用

水产生物种质鉴定包括：物种间的鉴定、物种内不同品种或不同地理群的鉴定、杂种的鉴定、亲子鉴定等。由于鱼类微卫星属共显性遗传，可以准确计算出所有等位基因的频率，因此在上述种质鉴定中具有一定的优越性。

3 微卫星标记在遗传育种方面的应用

微卫星标记用于水产动物的育种研究主要在2个方面，一是用微卫星分析群体、家系和个体的遗传差异，利用这些差异计算出群体间、家系间和个体间的遗传距离，再结合表型确定亲本配组方案，达到既优选出表型，又避免近亲交配的目的；二是依据QTL 等性状分析结果，利用与性状相关的微卫星等标记或基因来筛选出性状优良的个体，再从优秀个体建立品种或品系。

利用微卫星标记技术进行研究的前提是首先要得到微卫星序列。现较为流行的微卫星 DNA 获得途径主要是从基因组文库中获得含有微卫星的阳性克隆。目前在植物及哺乳动物中筛选微卫星序列的报道较多，但由于水产生物与植物及哺乳动物基因组序列的组成及微卫星重复序列的特点都有所差异，因此在适用以磁珠富集法筛选微卫星序列时在DNA提取方法及富集时探针的选择上需要进行相应调整。本发明根据淡水鱼类基因组及核酸序列特点在DNA的提取方法及富集过程中探针的选择上进行了创新，能够简单、快速的筛选出多数淡水鱼类整个基因组中的微卫星序列，在短时间内开发大量的微卫星引物。建立淡水鱼类微卫星DNA技术体系，使这些分子标记应用于在鱼类种质资源鉴定，遗传育种的研究。

发明内容

本发明的目的在于开发淡水鱼类微卫星序列的筛选方法，能够简单、快速的筛选出多数淡水鱼类整个基因组中的微卫星序列，在短时间内开发大量的微卫星引物。建立淡水鱼类微卫星DNA技术体系，使这些分子标记应用于在鱼类种质资源鉴定，遗传育种的研究。本发明适用于大多数淡水鱼类。

本发明的技术方案如下：

1、鱼类肌肉DNA的提取

通过对鱼类DNA提取效果进行多次比较的基础上，对提取方法进行了创新及改进，具体提取步骤如下：

(l)剪取豆粒大小的肌肉组织，用超纯水洗净肌肉上沾附的酒精，充分剪碎，放入1.5mL离心管中;

(2)向离心管中加入500μl的裂解液和5μl的蛋白酶K，在55℃消化至少3小时，每隔10分钟左右摇动一次，直至溶液澄清透明;

(3)将消化好的样品离心5分钟（5000rpm，4℃）使沉淀除去，取上清液移至新的管中。

(4)加入等体积的苯酚（约500μl)，将离心管置于旋转皿上缓慢颠倒20分钟，以温和的混匀两相后离心10分钟（8000rpm，4℃）。